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        高效液相色譜法測(cè)定芍藥中齊墩果酸和熊果酸含量

        2011-03-28 06:00:28周春華呂三三
        食品科學(xué) 2011年16期
        關(guān)鍵詞:齊墩標(biāo)樣果酸

        周春華,呂三三,張 瑩,胡 玥,陶 俊*

        (揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009)

        高效液相色譜法測(cè)定芍藥中齊墩果酸和熊果酸含量

        周春華,呂三三,張 瑩,胡 玥,陶 俊*

        (揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009)

        目的:建立高效液相色譜法測(cè)定芍藥不同器官中齊墩果酸和熊果酸含量的檢測(cè)方法。方法:超聲波乙醇提取樣品中的齊墩果酸和熊果酸,色譜柱為L(zhǎng)ichrospher C18柱(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15,V/V),柱溫30℃,流速1mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。結(jié)果:齊墩果酸和熊果酸在25~100μg/mL范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均在0.998(n=5)以上;日內(nèi)差異系數(shù)和日間差異系數(shù)分別為1.27%~2.96%和1.33%~3.64%,OA和UA精確性分別為1.28%~3.52%和0.96%~2.88%,平均回收率分別為98.87%和98.70%。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)單快速、結(jié)果準(zhǔn)確,可為測(cè)定芍藥不同組織中齊墩果酸和熊果酸含量提供一種高效快速的測(cè)定方法。

        高效液相色譜法;芍藥;齊墩果酸;熊果酸

        芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)是毛茛科芍藥亞科芍藥屬多年生宿根草本植物,主要分布在我國(guó)山東、浙江、安徽、河南、四川、云南、陜西和甘肅等地。芍藥根具有較高的藥用價(jià)值,是一種重要的中藥材,其生物活性物質(zhì)主要有單萜類化合物、三萜類化合物、揮發(fā)油、單寧、鞣質(zhì)、黃酮類及酚類等,其中單萜類化合物中的芍藥苷是芍藥中最主要的生物活性物質(zhì)[1-4]。而在藥用芍藥栽培中,地上部分常常被作為廢棄物丟棄,造成了資源的巨大浪費(fèi)。

        齊墩果酸(oleanolic ac id,OA)和熊果酸(ursolic acid,UA)是近年來倍受人們關(guān)注的三萜類化合物,兩者互為同分異構(gòu)體,通常以游離或結(jié)合成苷的形式廣泛存在于植物界。研究表明,它們主要存在于女貞子[5]、山茱萸[6]、白花蛇舌草[7]、柿[8]、枇杷[9]、棗[10]、山楂[11]和木瓜[12]等植物中。醫(yī)學(xué)研究表明,OA和UA均具有抗腫瘤[13]、抗病毒[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、護(hù)肝[17]、降血糖[18]等多種生物活性。以往關(guān)于芍藥的藥用研究主要集中在根上,其化學(xué)成分主要以單萜化合物為主,迄今為止,尚未見有關(guān)芍藥三萜化合物OA和UA的研究報(bào)告。預(yù)試驗(yàn)研究顯示,芍藥葉片、花朵、莖干中均含有OA和UA等三萜類化合物,其中葉片含量最高。

        植物中OA和UA的含量分析方法主要包括薄層掃描法(thin layer chromatography scanning,TLCS)、毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis,CE)、氣相色譜法(gas chromatography,GC)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)。其中HPLC是最常見的分析方法,使用此方法在女貞子[5]、山茱萸[6]、白花蛇舌草[7]、柿[8]、枇杷[9]、棗[10]、山楂[11]和木瓜[12]等多種植物中均同時(shí)檢測(cè)到了OA和UA。

        本實(shí)驗(yàn)以O(shè)A和UA的含量作為考察指標(biāo),利用超聲提取,建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確測(cè)定芍藥不同組織中OA和UA含量的高效液相色譜檢測(cè)方法,為芍藥資源的綜合利用研究提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)采自揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院芍藥種質(zhì)資源圃內(nèi)。選取“楊妃出浴”、“粉珠盤”和“紅峰”3個(gè)品種,于2009年5月1日采集上述3個(gè)品種葉片、花朵和莖干樣品。所有采集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后立即用液氮冷凍處理,然后存放在-20℃冰箱中,直至分析。

        OA、UA標(biāo)準(zhǔn)品 南京替斯艾么(TCM)中藥研究所;甲醇(HPLC級(jí)) 美國(guó)Tedia試劑公司;去離子水由Millipore超純水系統(tǒng)制備;其他試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        2695高效液相色譜儀[配備2487紫外檢測(cè)器和Lichrospher C18柱(250mm×4.6mm,5μm)] 美國(guó)Waters公司;RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;KQ-500B超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器有限公司;TDL-40B離心機(jī) 上海金鵬分析儀器有限公司;分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;微孔濾膜(0.22μm)。

        1.3 方法

        1.3.1 色譜條件

        OA和UA的定量在高效液相色譜儀系統(tǒng)中進(jìn)行。兩種物質(zhì)均在210nm波長(zhǎng)處檢測(cè),流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15,V/V)。流速為1mL/min,柱溫為30℃。

        1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

        OA和UA標(biāo)準(zhǔn)樣品分別用甲醇配成2mg/mL貯備液。分別量取OA和UA標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液0.025mL置于同一個(gè)離心管中,加入甲醇1.975mL,搖勻,制成OA和UA質(zhì)量濃度分別為25μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述方法配制OA和UA質(zhì)量濃度分別為50、75、100μg/ mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在進(jìn)行HPLC測(cè)定時(shí),上述不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣10μL測(cè)定峰面積,用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.3 分析方法驗(yàn)證

        按1.3.2節(jié)方法制備標(biāo)準(zhǔn)溶液,對(duì)4個(gè)質(zhì)量濃度的OA和UA標(biāo)樣進(jìn)行HPLC測(cè)定,精密吸取每一標(biāo)樣溶液10μL,按上述色譜條件連續(xù)3次進(jìn)樣,根據(jù)標(biāo)樣質(zhì)量濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸分析。

        為了測(cè)定每個(gè)標(biāo)樣的日內(nèi)差,每個(gè)質(zhì)量濃度在同1d內(nèi)注射5針。然后連續(xù)3d進(jìn)行測(cè)定以確定日間的精確度(即日間差)。

        為了計(jì)算提取回收率,在提取前于研磨好的3g植物材料(“楊妃出浴”葉片)中加入30μg OA和300μg UA。此后的提取和HPLC分析均按照上述方法進(jìn)行操作,并計(jì)算回收率。

        式中:A是加入標(biāo)樣后檢測(cè)到的含量;B是沒有加標(biāo)樣時(shí)檢測(cè)到的含量;C是加入標(biāo)樣的量。

        1.3.4 待測(cè)液的制備

        用天平稱取3.0g鮮樣,置于研缽中,加液氮研至粉末狀,放入10mL離心管中,加入5mL乙醇,在超聲波清洗器中提取30min,15℃、8000×g離心10min。每樣品總共提取2次,合并兩次濾液,35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥。殘留物溶于1.5mL甲醇中,并轉(zhuǎn)移至2mL離心管中。在HPLC上樣前用0.22μm微孔濾膜過濾。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

        1.3.5 樣品測(cè)定

        將處理后的樣品溶液進(jìn)行液相色譜分析,進(jìn)樣量10μL,采用外標(biāo)法定量,測(cè)定3個(gè)品種芍藥葉片、花朵和莖干中OA和UA的含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 HPLC鑒定OA和UA

        OA和UA標(biāo)樣在210nm波長(zhǎng)處均能檢測(cè)到,且在210nm左右有最大吸收峰。在甲醇(A)和0.1%磷酸溶液(B)配比為85∶15(V/V)時(shí),OA和UA能有效地洗脫,而且能被同時(shí)檢測(cè)。在流速為1mL/min時(shí),OA和UA的保留時(shí)間分別為26.086、27.229min(圖1a)。這種HPLC體系能成功分離芍藥葉片中的OA和UA(圖1b)。

        2.2 檢測(cè)方法確認(rèn)

        2.2.1 線性關(guān)系

        兩種標(biāo)準(zhǔn)品配制4種不同質(zhì)量濃度(25、50、75、100μg/mL)的溶液,分別重復(fù)5次測(cè)試。校準(zhǔn)曲線均呈線性關(guān)系,峰面積(Y)與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(X)的回歸方程為:YOA=1217.2X(r=0.998),YUA=1499.6X(r=0.998),表明OA和UA在25~100μg/mL范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系,可用于定量分析。

        2.2.2 重復(fù)性和精確度

        表1 OA和UA重復(fù)性和精確性分析(n=5)Table 1 Repeatability and accuracy of OA and UA analysis (n=5)

        3種標(biāo)樣的重復(fù)性和精確度采用上述方法,通過4種不同的質(zhì)量濃度來分析測(cè)定(表1)。OA和UA的日內(nèi)差異系數(shù)分別為1.46%~2.84%和1.27%~2.96%,日間差異系數(shù)分別為1.33%~3.32%和1.97%~3.64%。方法的精確性用測(cè)定值與所有質(zhì)量濃度理論值的偏差來表示,OA和UA的精確性分別為1.28%~3.52%和0.96%~2.88%。

        2.2.3 回收率實(shí)驗(yàn)分析

        為了計(jì)算提取回收率,在提取前于研磨好的3g植物材料中加入30μg OA和300μg UA。然后按上述方法進(jìn)行提取、檢測(cè)和分析。通過計(jì)算分析值和加入量的比例分別來計(jì)算3種成分的回收率。結(jié)果表明,OA和UA的回收率分別為98.87%和98.70%(表2)。

        2.3 芍藥不同器官OA和UA含量分析

        由表3可知,芍藥不同器官中OA和UA含量差別很大,以 楊妃出浴 、 粉珠盤 和 紅峰 3個(gè)品種為例,3個(gè)品種不同組織中均檢測(cè)到OA和UA,且UA含量均高于OA。對(duì)于葉片和花朵來說,3個(gè)品種中OA和U A的含量均以“楊妃出浴”最高,“粉珠盤”最低,“紅峰”介于其中。而對(duì)于莖干來說,3個(gè)品種中OA和UA的含量則以“粉珠盤”最高,“紅峰”最低,“楊妃出浴”介于其中。從3種不同器官OA和UA的總量來看,葉片明顯高于花和莖干,其中“楊妃出浴”葉片中OA和UA總量最高,為119.56μg/g,“粉珠盤”最低,為54.54μg/g。

        表3 芍藥不同器官OA和UA的含量Table 3 OA and UA contents in different organs of peonyμg/g

        3 討論與結(jié)論

        3.1 芍藥中OA和UA分析體系的建立

        常用的流動(dòng)相系統(tǒng)有甲醇-水和乙腈-水兩種。甲醇和乙腈的體積分?jǐn)?shù)一般在85%~90%[19]。在流動(dòng)相加入少量冰醋酸(0.08%~0.1%)、磷酸(0.1%)、三乙胺(0.06%~0.1%)有利于改善峰形,提高分離度[20]。本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)甲醇-磷酸緩沖液(88∶12,V/V)、甲醇-水(85∶15,V/V)和甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15,V/V)這3種不同流動(dòng)相做過對(duì)比篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇-磷酸緩沖液做流動(dòng)相時(shí),由于鹽的存在,色譜柱容易堵塞。采用甲醇-水做流動(dòng)相,OA和UA的分離度小于1,且峰形不好,在水中加入0.1%磷酸,其分離度較高,峰形也得到較好的改善。對(duì)流動(dòng)相的流速進(jìn)行選擇發(fā)現(xiàn),流速對(duì)出峰時(shí)間影響較大,在流速0.6mL/min時(shí),出峰時(shí)間大約在50min左右,而當(dāng)流速升到1mL/min時(shí),出峰時(shí)間縮短到30min左右。許多文獻(xiàn)[7-9,11-12]中OA和UA的保留時(shí)間在18~29min之間,本實(shí)驗(yàn)OA和UA的保留時(shí)間分別為26.086、27.229min,和文獻(xiàn)結(jié)果基本一致。在本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件下,芍藥不同器官中OA和UA的分離良好,方法簡(jiǎn)便快速,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。同時(shí)用該方法對(duì)柿子果肉和果皮中OA和UA含量進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其峰形和分離度也較好,說明該方法有一定的普適性。

        3.2 芍藥不同組織器官中OA和UA的含量

        研究表明,OA和UA在同種植物的不同組織器官中的含量存在著很大差異。王麗萍等[21]研究發(fā)現(xiàn),川鄂山茱萸總苞片的UA含量(1.1044%)最高、果實(shí)(0.0899%)最低,莖干、葉片和花介于中間,同一器官的不同組織部位中的OA和UA的含量也有差別。劉名權(quán)等[22]研究顯示,毛泡桐葉片中的OA含量(0.222%)約為葉柄(0.025%)的9倍,葉片中UA的含量(0.61%)約為葉柄(0.21%)的3倍。周春華[23]研究表明枇杷花萼片的OA和UA含量最高,分別為0.68、3.65mg/g,花瓣中OA和UA的含量最低,分別為0.12mg/g和0.60mg/g,雌雄蕊和穗梗中OA和UA的含量介于萼片和花瓣之間。

        本研究顯示,芍藥不同器官OA和UA含量差別很大,3個(gè)芍藥品種“楊妃出浴”、“粉珠盤”和“紅峰”的OA和UA含量均以葉片最高。OA在葉片中的含量分別是莖干的72.7、1.3、11.4倍,花的2.7、23.5、21.2倍;UA在葉片中的含量分別是莖干的30.2、39.7、35.6倍,花的65.0、5.8、190.4倍。

        3.3 本研究建立了高效液相色譜測(cè)定芍藥不同器官中OA和UA含量的方法,該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便易行,結(jié)果穩(wěn)定可靠,可以快速準(zhǔn)確地對(duì)芍藥不同器官中OA和UA進(jìn)行定量分析,可為芍藥資源的綜合開發(fā)利用研究提供參考。

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        Analysis of Oleanolic and Ursolic Acids in Peony (Paeonia lactiflora Pall. ) by HPLC

        Objective∶ To establish a HPLC method to determine the contents of oleanolic acid (OA) and ursolic acid (UA) in different organs of Paeonia lactiflora Pall.. Method∶ Oleanolic and ursolic acids were extracted from samples with ethanol under the assistance of ultrasonic. The chromatographic separation was conducted on a Lichrospher C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5μm) using a mobile phase made up of methanol and 0.1% phosphoric acid solution (85∶15, V/V) at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature and the detection wavelength were set as 30 ℃ and 210 nm, respectively. Results∶ The linearity of OA and UA was in the range of 25-100μg/mL with a correlation coefficient over 0.998 (n = 5). The overall intra-day and inter-day variation coefficients were 1.46%-2.84% and 1.33%-3.32% for OA and 1.27%-2.96% and 1.97%-3.64% for UA, respectively. The accuracy of determination of OA and UA was 1.28%-3.52% and 0.96%-2.88%, respectively. Conclusion∶The method is convenient, rapid and accurate, and can thus be used to separate and quantify OA and UA in different organs of Paeonia lactiflora Pall..

        high performance liquid chromatography (HPLC);Paeonia lactiflora Pall.;oleanolic acid;ursolic acid

        TS255.1

        A

        1002-6630(2011)16-0265-04

        2010-11-03

        2009年揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目;“十一五”江蘇省科技支撐計(jì)劃(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(BE2009318);江蘇省科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計(jì)劃(科技公共服務(wù)平臺(tái))項(xiàng)目(BM2010590)

        周春華(1974—),男,副教授,博士,研究方向?yàn)閳@藝植物生物活性物質(zhì)。E-mail:chzhou@yzu.edu.cn

        *通信作者:陶俊(1966—),男,教授,博士,研究方向?yàn)橛^賞植物栽培與遺傳生理。E-mail:taojun@yzu.edu.cn

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