張立平

(溧水縣人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 南京 211200)

目前異丙酚的腦保護研究主要以神經(jīng)元為對象，有關(guān)異丙酚對胚胎中腦神經(jīng)細胞缺氧復(fù)氧損傷的影響報道較少。異丙酚是臨床十分常用的麻醉鎮(zhèn)靜藥[1，2]，有研究顯示異丙酚具有一定的腦保護作用[3]。本實驗旨在進一步研究異丙酚干預(yù)胚胎中腦神經(jīng)細胞后缺氧復(fù)氧損傷神經(jīng)細胞形態(tài)、乳酸脫氫酶、脂質(zhì)過氧化的影響,進一步說明異丙酚對腦缺血再灌注損傷有保護作用，為異丙酚在臨床上的進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 14d胚胎大鼠，體重為250～300g(江蘇大學(xué)實驗動物中心提供)。

1.2 主要試劑和儀器 小牛血清(杭州四季青生物公司)；DMEM培養(yǎng)基為(美國Sigma公司)；異丙酚由暨南大學(xué)生物工程研究所提供(純度＞95%)；MTT(武漢博士德生物工程有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CO2培養(yǎng)箱為(Forma Scientific，USA)；ELx800 酶標儀 (美國 BIO-TEK公司)。IX70-S8F/SIF-141倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本)；GNL-B3氧量分析儀(上海昶艾電子科技有限公)； 95%N2-5%CO2混合氣平衡過的單向氣流缺氧裝置(蘇州安創(chuàng)儀器有限公司)。

1.3 胚胎中腦神經(jīng)細胞的制備 用脫頸椎法處死妊娠14 d孕鼠，在無菌條件下分離出胎鼠中腦，浸入37℃的胎牛血清。 Hanks平衡液(1:1v/v)5～10min，用Hanks液漂洗3次后，用0.25%胰蛋白酶消化10min，加入小牛血清終止消化后經(jīng)200目鋼絲網(wǎng)篩過濾，離心洗去胰蛋白酶。加入DMEM培養(yǎng)液(內(nèi)含50U/ml的青霉素，50μg/ml的鏈霉素和15%小牛血清)制備細胞懸液，計數(shù)細胞存活率，采用臺盼藍計數(shù)活細胞。結(jié)果活細胞率為90%，再用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整至3×105個細胞/ml的細胞，將細胞懸液接種于培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞培養(yǎng)24h后進行后續(xù)試驗。

1.4 胚胎中腦神經(jīng)細胞缺氧損傷模型的建立 取培養(yǎng)24小時的神經(jīng)細胞，用15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng),(預(yù)先充入95%N2-5%CO2混合氣和30min)，而后迅速將培養(yǎng)細胞移入同種95%N2-5%CO2混合氣平衡過的單向氣流缺氧裝置,測氧儀監(jiān)測排氣口氧濃度(＜1%)，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中缺氧6h后進行MTT實驗及生化指標的測定。

1.5 實驗分組 將胚胎中腦神經(jīng)細胞分組 正常對照組、缺氧損傷模型組、異丙酚干預(yù)組(濃度分別為10、25、50、100μmol/L)。 1.5MTT 法檢測神經(jīng)元細胞存活率 以4×105個細胞/ml的細胞接種于96孔培養(yǎng)板的神經(jīng)細胞，缺氧損傷模型組及異丙酚干預(yù)組缺氧處理24h，正常對照組37℃、5%CO2培養(yǎng)箱同步孵育，每孔加入 MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，振蕩 10min，于酶標儀波長 490nm處測吸光度值。每實驗組設(shè)6個復(fù)孔。

1.6 細胞外LDH活性的測定 接種于24孔板的神經(jīng)元，缺氧損傷模型組及異丙酚干預(yù)組缺氧處理24h，正常對照組37℃、5%CO2培養(yǎng)箱同步孵育，取各組細胞培養(yǎng)上清液200μl，用比色法測定LDH的活力,具體檢測過程及操作方法參見試劑盒說明書進行。

1.7 細胞內(nèi)SOD活性、MDA和GSH含量測定 接種于24孔板的神經(jīng)元,各實驗組處理同上，0.25%胰酶消化，血清中止，離心1000r/min，10min，去上清后，每孔加入0.1mol/L TBA-0.05mmol/L EDTA(pH=8.0)1ml，再加入 50μl 1%Triton-X100，將培養(yǎng)板置于震蕩器上震蕩 1min使細胞溶解，加入100μl 25%HPO3以沉淀蛋白，10000r/min 4℃離心。用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，用改良二硫雙硝基苯甲酸定量法測定GSH活性，按硫代巴比妥酸(Thibabituric acid，TBA)比色法測定MDA含量。用黃嘌呤氧化酶法測定細胞內(nèi)SOD活性；用硫代巴比妥酸比色法測定細胞內(nèi)MDA含量，具體檢測過程及操作方法參見試劑盒說明書。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，對均值進行t檢驗。

2 結(jié)果

圖1 正常對照組神經(jīng)細胞形態(tài)(×200)

圖2 缺氧組細胞形態(tài)(×200)

圖3 異丙酚(40～80μg/L)和缺氧組神經(jīng)細胞形態(tài)(×200)

圖4 異丙酚(100μg/L)和缺氧組神經(jīng)細胞形態(tài)(×200)

2.1 異丙酚對大鼠胚胎中腦神經(jīng)細胞形態(tài)觀察 由見圖1～圖4，用倒置顯微鏡下觀察活細胞生長情況,對照組細胞形成團簇，突起增長，并借突起彼此連接形成網(wǎng)絡(luò)，細胞呈梭形或椎形，核大而圓，有折光性，位于細胞中央，細胞界限清楚。缺氧24h的模型組可見各組神經(jīng)細胞突起變少或消失，細胞團松散，表現(xiàn)為缺氧損傷狀態(tài)。缺氧后加異丙酚組神經(jīng)細胞形態(tài)基本正常，異丙酚對胚胎中腦神經(jīng)細胞具有明顯保護作用。缺氧24h后細胞集落及細胞數(shù)有明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，異丙酚(40、80、100μg/L)對缺氧胚胎中腦神經(jīng)細胞逐漸增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 MTT檢測神經(jīng)元細胞存活率 由表1可見，MTT測定結(jié)果，缺氧模型組與正常對照組比較，OD值均有所下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；異丙酚劑量(20～100μg/L)干預(yù)缺氧24h后對神經(jīng)細胞生存率OD值較模型組均有所增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，P＜0.01)。

表1 異丙酚對神經(jīng)細胞培養(yǎng)生存率的影響s，n=5)

表1 異丙酚對神經(jīng)細胞培養(yǎng)生存率的影響s，n=5)

注：與正常對照組相比(*P＜0.05；**P＜0.01)；與缺氧模型組和異丙酚干預(yù)組相比，**P＜0.01。

組別 劑量(μg/L) OD值(24h)正常對照組缺氧模型組異丙酚干預(yù)組--1 0 20 40 80 100 0.659±0.032 0.4280.053**0.460±0.032 0.491±0.045*0.562±0.024**0.684±0.052**0.596±0.064**

2.3 異丙酚對神經(jīng)元細胞培養(yǎng)上清液中LDH活力的影響 由表2可見。神經(jīng)元細胞經(jīng)缺氧處理后，上清液中的LDH活力增高，與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)；異丙酚組可以顯著降低細胞中LDH活力，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 異丙酚對神經(jīng)細胞培養(yǎng)上清液中LDH活力的影響(±s，n=5)

表2 異丙酚對神經(jīng)細胞培養(yǎng)上清液中LDH活力的影響(±s，n=5)

注： 與正常對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量(μg/L) LDH(U/L)正常對照組缺氧模型組異丙酚干預(yù)組--1 0 20 40 80 100 78.52±16.26 241.52±14.21**132.32±16.35 134.24±15.84*148.72±13.34**162.34±17.62**151.54±15.64**

2.4 異丙酚對缺氧損傷神經(jīng)元細胞內(nèi)SOD活性、MDA及GSH含量的影響

表3 異丙酚對缺氧損傷神經(jīng)細胞內(nèi)SOD活性、MDA和GSH 含量的影響±s，n=5)

表3 異丙酚對缺氧損傷神經(jīng)細胞內(nèi)SOD活性、MDA和GSH 含量的影響±s，n=5)

注： 與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與正常對照組比較，*P＜0.05**P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01。

組別 劑量(μg/L)SOD(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)GSH(mg/g ptor)正常對照組缺氧模型異丙酚干預(yù)組--1 0 20 40 80 100 87.36±18.35 30.69±11.32**62.54±9.47 60.42±7.42**50.72±5.62**48.35±6.34**42.36±4.33**7.592±0.54 10.52±1.36*4.36±1.25 6.624±1.82*5.941±0.76*6.375±0.92*6.824±0.84*72.72±9.72 92.65±10.53 71.38±9.72 69.37±8.74*52.32±7.54*49.52±6.33*42.64±6.47*

由表3可見。缺氧組與正常對照組比較，細胞內(nèi)SOD活性顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)，MDA、GSH含量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；而異丙酚 40～100μg/L 處理組，與缺氧模型組比較均可減少細胞內(nèi)SOD活性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，MDA和GSH含量的產(chǎn)生，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

氧化損傷是引起缺血再灌注損傷的重要機制之一，在大鼠心臟缺血再灌注過程中，異丙酚輸注能減少MDA含量和提高SOD活性，并呈劑量依賴性，丙二醛(MDA)是氧化損傷過程中脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物；超氧化物岐化酶(SOD)能清除氧自由基，其活性反映了機體抗氧化損傷的能力[4]，與組織損傷的程度密切相關(guān)。異丙酚是一種抗炎劑通常用于全身麻醉、鎮(zhèn)靜在加護病房的病人[5]。臨床上尚未見不良反應(yīng)，但仍然存在一些不足之處。藥物給藥途徑與劑型方面有待改進，使藥物定位準確具有選擇性的治療作用，從而使受損部位能達到有效濃度，當神經(jīng)細胞因缺血缺氧受到損傷時，線粒體功能異常，氧化呼吸鏈受損，電子傳遞阻斷，ATP產(chǎn)生減少。琥珀酸脫氫酶是琥珀酸氧化呼吸鏈里重要的復(fù)合酶之一，所以，琥珀酸脫氫酶的活性，可以反映神經(jīng)細胞缺氧損傷的程度。本實驗表明，缺氧損傷模型組比正常對照組吸光度值顯著性降低，結(jié)果表明細胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶的活性已經(jīng)降低，細胞呼吸功能受損，說明缺氧24h可以損害神經(jīng)細胞代謝能力。乳酸脫氫酶(LDH)的測定來評估和量化細胞死亡[6]，與缺氧損傷模型組比較，異丙酚各劑量組可以顯著提高細胞活性，說明異丙酚能對抗缺氧對神經(jīng)細胞琥珀酸脫氫酶活性的損害，維持缺氧損傷細胞的呼吸功能。乳酸脫氫酶是參與細胞能量代謝的一個重要的酶。同時產(chǎn)生ATP。缺氧導(dǎo)致細胞急性損傷時，細胞膜完整性遭到破壞，胞通透性增加，LDH將從胞漿中釋放出來，在離體神經(jīng)細胞培養(yǎng)中可以引起細胞活力的下降，活細胞數(shù)目的減少，乳酸脫氫酶(LDH)的釋放增加因此LDH是反映胞膜完整性的重要檢測指標[7]。與缺氧損傷模型組比較，異丙酚各劑量組均可顯著減少缺氧條件神經(jīng)元細胞LDH的外漏量，一定程度上保持了神經(jīng)元膜的完整性。在神經(jīng)元缺血缺氧的同時，活性氧爆發(fā)性產(chǎn)生，而組織中清除氧自由基的SOD活性卻降低了，導(dǎo)致氧自由基堆積,使膜脂質(zhì)過氧化而致細胞損傷當體內(nèi)有過量的氧自由基時，就會啟動脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，在導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力受損[8]。本實驗結(jié)果顯示，缺氧24h的模型組可見各組神經(jīng)細胞形態(tài)，細胞集落及細胞數(shù)有明顯下降，突起變少，表現(xiàn)為缺氧損傷狀態(tài)。異丙酚可以增強了強抗氧化酶心肌細胞內(nèi)SOD活性，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。且隨異丙酚的劑量增高其抑制效應(yīng)加強。缺氧后加異丙酚組神經(jīng)細胞形態(tài)基本正常當異丙酚劑量在25、50、100μg/L范圍內(nèi)對缺氧神經(jīng)細胞逐漸增多作用。說明異丙酚對胚胎中腦神經(jīng)細胞具有明顯保護作用。

綜上所述，異丙酚可顯著減少缺氧條件神經(jīng)元LDH的外漏量，一定程度上保持了神經(jīng)元膜的完整性。另也通過增強神經(jīng)細胞清除自由基的能力，對抗缺氧導(dǎo)致的細胞膜氧化損傷，對缺氧損傷神經(jīng)細胞具有明顯的保護作用。并通過內(nèi)在抗氧化機制恢復(fù)和增強了抗氧化酶活性，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起的細胞內(nèi)損傷。

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