李沅，姜熙，樊鉑，崔紅天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，天津，300191

高效液相色譜法測(cè)定藥物涂層支架中zotarolimus的含量

【作者】李沅，姜熙，樊鉑，崔紅天津市醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，天津，300191

目的建立藥物涂層支架中zotarolimus的含量測(cè)定方法。方法高效液相色譜法，使用Zorbax Eclipse XDB-C8(4.6×75 mm 3.5 μm)色譜柱；流動(dòng)相MPA(醋酸鹽緩沖液：乙腈=51:49)、 MPB(醋酸鹽緩沖液：乙腈=5:95)；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。結(jié)果在質(zhì)量濃度5 μg/ml～75 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.99986)，平均回收率為101.58%，RSD=0.68% (n=6)。結(jié)論本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于藥物涂層支架中zotarolimus的含量測(cè)定。

高效液相色譜法；藥物涂層支架；zotarolimus；含量測(cè)定

藥物涂層支架是將藥物直接或通過(guò)適當(dāng)?shù)妮d體涂布于金屬支架表面，成為一種藥物緩釋系統(tǒng)。廣義的藥物涂層支架分為兩大類：一類是在支架表面包被磷酸膽堿、肝素、碳化物和硅碳合金等，以減少血栓的形成或降低再狹窄率（被動(dòng)涂層）；另一類則是通過(guò)支架表面的特定載體控制釋放某些抗增生的藥物（如雷帕霉素或紫杉醇等）或基因、細(xì)胞等，通過(guò)與血管壁持續(xù)作用而抑制支架術(shù)后血管內(nèi)膜的過(guò)度增生，從而降低再狹窄的發(fā)生率（主動(dòng)涂層）。后者常被稱為藥物洗脫支架[1]。藥物在局部以“洗脫”方式緩慢釋放，可以滿足靶部位的有效藥物濃度，降低全身毒副反應(yīng)，并在（涂層）對(duì)藥物的緩釋作用下獲得足夠的作用時(shí)間。Zotarolimus涂層支架是美國(guó)美敦力公司的產(chǎn)品。Zotarolimus作為雷帕霉素的一種新型衍生物，具有較強(qiáng)的抗冠脈平滑肌細(xì)胞增殖的活性，且能有效抑制免疫機(jī)制的作用[2]。研究表明，Zotarolimus洗脫支架在4周后可明顯起到降低內(nèi)膜增生的作用[3]。

由于藥物涂層支架在預(yù)防冠脈再狹窄方面較金屬裸支架具有明顯優(yōu)勢(shì)，因此近年來(lái)帶藥支架在冠脈介入治療中的應(yīng)用數(shù)量日趨增多。然而，目前國(guó)內(nèi)的醫(yī)療器械質(zhì)檢部門(mén)對(duì)藥物涂層支架中的藥物成分分析和含量測(cè)定的研究尚處于起步階段，相關(guān)研究報(bào)道較少。這主要是由于不同器械制造商的涂藥工藝，涂層特性和藥物種類千差萬(wàn)別，給藥物涂層支架中的藥物提取和鑒別測(cè)定帶來(lái)了一定的困難。針對(duì)不同設(shè)計(jì)屬性的器械，質(zhì)檢機(jī)構(gòu)需要設(shè)計(jì)不同的試驗(yàn)方案，并在此基礎(chǔ)上對(duì)分析特定藥物的色譜條件進(jìn)行研究。本文在大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立了Zotarolimus涂層支架中藥物含量的高效液相色譜測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定，為保證該類產(chǎn)品的質(zhì)量提供了有價(jià)值的質(zhì)控方案。

1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)，UV紫外檢測(cè)器，G1316A型色譜工作站。Zotarolimus對(duì)照品(臺(tái)灣神隆股份有限公司提供 Batch No：71061AA019)。zotarolimus藥物涂層支架（批號(hào)為0001928216，0001928217，0001928218，美國(guó)美敦力公司提供)。乙腈為色譜純，醋酸氨為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C8(4.6×75 mm 3.5 um )；流動(dòng)相MPA（醋酸鹽緩沖液：乙腈=51:49）和 MPB（醋酸鹽緩沖液：乙腈=5:95）；梯度洗脫時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫時(shí)間表Tab.1 Gradient elution time-table

采集前27 min內(nèi)的數(shù)據(jù)。

2.2測(cè)試條件

柱溫45±2oC；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；流速1.5 ml/min；進(jìn)樣量20 μl。

2.3溶液配制

2.3.1 供試品溶液 用移液管精密量取適量MPA移入棕色試樣瓶中，將測(cè)試藥物支架置入提取介質(zhì)中(支架必須完全浸入浸提介質(zhì)中)。用聚四氟乙烯內(nèi)襯螺帽蓋住試樣瓶。用超聲波對(duì)樣品進(jìn)行加速溶解，（超聲波水浴溫度控制在20oC～35oC）。提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液直接進(jìn)樣分析。

2.3.2 對(duì)照品溶液 精密稱取Zotarolimus對(duì)照品20 mg，用乙醇定容至100 ml容量瓶，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用移液管將2.5 ml、7.5 ml、12.5 ml、25 ml、37.5 ml儲(chǔ)備液移入100 ml容量瓶，并用MPA進(jìn)行稀釋，制得5 μg、15 μg、25 μg、50 μg、75 μg /ml對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC curves

2.4 方法適用性試驗(yàn) 依給定的色譜條件，分別取空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。它們的色譜圖分別為圖A、圖B和圖C。zotarolimus主峰的保留時(shí)間約為22 min,與其異構(gòu)體組分峰的分離度為2.18，理論板數(shù)為7293[4]。

2.5線性關(guān)系

分別取“2.3.2”項(xiàng)下方法配制的對(duì)照品溶液，按給定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各濃度的色譜峰面積。以峰面積(Y)對(duì)溶液濃度(X)求回歸方程為Y=3611108X-2.45596(r=0.99986)，在5 μg/ml～75 μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.6精密度試驗(yàn)

取濃度為25 μg/ml的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，RSD=0.47%，表明所選定的色譜條件系統(tǒng)穩(wěn)定。

2.7重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)0001928216）5件，按“2.3.1”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果的RSD=0.43%(n=5)，表明方法重現(xiàn)性好。

2.8回收率試驗(yàn)

取6份已知含量的樣品，分成3組，每組分別加入對(duì)照品溶液（200 μg/ml）0.2ml、0.1ml、0.05 ml，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，測(cè)得平均回收率為101.58%，RSD=0.68%(n=6)。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the labeled recovery rate（n=6）

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按給定的色譜條件在 0 h、2 h、4 h、6 h和8 h分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，RSD=0.9%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10樣品含量測(cè)定

取3批樣品，分別按供試品溶液的制備方法，制備待測(cè)溶液。取20μl進(jìn)樣，分別進(jìn)樣2次，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，記錄色譜圖見(jiàn)圖1C，結(jié)果見(jiàn)表2。另按給定的色譜條件，取20 μl標(biāo)準(zhǔn)品及空白溶液進(jìn)樣，分別記錄色譜圖，見(jiàn)圖1B和圖1A。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，3批樣品含量測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of the sample drug content（n=3）

3 討論與小結(jié)

3.1 由于溶劑及藥物中的其它雜質(zhì)在100%MPA的流動(dòng)相條件下洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，為了縮短分析時(shí)間，同時(shí)避免雜質(zhì)峰對(duì)下一個(gè)待測(cè)樣品的干擾，故采用梯度洗脫的方式。在Zotarolimus及其異構(gòu)體完全洗脫后，改變流動(dòng)相比例達(dá)到快速分離雜質(zhì)的目的。

3.2 將Zotarolimus對(duì)照品溶液置紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于240 nm～320 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定待測(cè)物質(zhì)Zotarolimus的最大吸收波長(zhǎng)為278 nm,并以此作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 在樣品處理過(guò)程中，超聲處理可使樣品溶解充分，經(jīng)超聲處理可去除未被濾除的微小不溶物，以確保溶液澄清。超聲波水浴溫度控制在20oC～35oC，防止zotarolimus分解。

3.4 本試驗(yàn)待測(cè)組分有兩個(gè)色譜峰，分別是zotarolimus及其異構(gòu)體，應(yīng)按峰面積加和法計(jì)算。此方法更能準(zhǔn)確測(cè)定zotarolimus總量。

3.5 通過(guò)對(duì)3批藥物支架含量的測(cè)定表明，該方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定。由于藥物支架的含量測(cè)定方法國(guó)內(nèi)報(bào)道不多，故此研究為保證該產(chǎn)品的質(zhì)量提供了有價(jià)值的測(cè)定方法。

[1] 馬長(zhǎng)生. 冠心病介入治療——技術(shù)與策略[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001

[2] Chen YW, Smith ML, Sheets M, et al. Zotarolimus, a novel sirolimus analogue with potent anti-proliferative activity on coronary smooth muscle cells and reduced potential for systemic immunosuppression[J]. Cardiovasc Pharmacol, 2007, 49: 228-235.

[3] Garcia-Touchard A,Burke SE, Toner JT, Cromack K, Schwartz RS.Zotarolimus-eluting stents reduce experimental coronary artery neointimal hyperplasia after 4 weeks[J]. Eur Heart, 2006, 27: 988-993.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部), 附錄VD. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005

國(guó)產(chǎn)智能膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)

膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)與傳統(tǒng)消化系統(tǒng)內(nèi)鏡檢查不同，患者在吞服智能膠囊后，智能膠囊在其消化道內(nèi)運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中，可對(duì)消化道壁進(jìn)行實(shí)時(shí)攝像，并將數(shù)字信號(hào)傳輸至患者體外攜帶的圖像記錄儀上。醫(yī)生借助圖像記錄儀和影像工作站系統(tǒng)分析所采集到的圖像，便可對(duì)病情做出進(jìn)一步診斷，而膠囊則隨患者排泄物自行排出。整個(gè)過(guò)程無(wú)創(chuàng)傷、無(wú)痛苦、無(wú)交叉感染，不影響患者的正常工作，免除了傳統(tǒng)檢測(cè)方法所帶來(lái)的痛苦和不便，同時(shí)又解決了傳統(tǒng)內(nèi)鏡不能較好檢查小腸部位的問(wèn)題。

膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)是微電子技術(shù)、圖像處理技術(shù)、無(wú)線通信技術(shù)等與生物醫(yī)學(xué)相結(jié)合的一項(xiàng)高科技項(xiàng)目，回音必集團(tuán)杭州華沖科技有限公司承擔(dān)國(guó)家“863”計(jì)劃微電子領(lǐng)域課題、國(guó)家醫(yī)療診斷設(shè)備重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目研制工作的數(shù)年間，在國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目組的指導(dǎo)和協(xié)助下，科研人員堅(jiān)持不懈地創(chuàng)新，在HT型膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)在低功耗數(shù)?；旌霞呻娐沸酒鉀Q方案、低功耗SOC系統(tǒng)設(shè)計(jì)、射頻無(wú)線啟動(dòng)開(kāi)關(guān)、醫(yī)學(xué)圖像處理以及高清數(shù)字視頻的研發(fā)等方面獲得重大突破，達(dá)到世界先進(jìn)水平。

HT型膠囊內(nèi)鏡系統(tǒng)的體積、分辨率和重量等方面與國(guó)內(nèi)同類型產(chǎn)品相比，有明顯改進(jìn)。尤其是膠囊內(nèi)的核心技術(shù)部分——主控芯片，擁有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。該項(xiàng)創(chuàng)新降低了膠囊式內(nèi)窺鏡的功耗和成本。在采用相同電池的情況下，該膠囊式內(nèi)窺鏡的工作時(shí)間比同類產(chǎn)品長(zhǎng)1.5～2倍，這樣醫(yī)生就有足夠的時(shí)間進(jìn)行完整的小腸檢查，即使對(duì)腸胃蠕動(dòng)能力差的患者也可以輕松完成。

2011年3月1日，HT型膠囊式內(nèi)窺鏡系統(tǒng)獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的醫(yī)療器械注冊(cè)證。3月7日-14日在北京國(guó)家會(huì)議中心“十一五”國(guó)家重大科技成就展醫(yī)藥重大專項(xiàng)展區(qū)展出，受到好評(píng)。

全球消化系統(tǒng)疾病發(fā)病率逐年上升，我國(guó)每年就有至少8000萬(wàn)人接受胃腸道疾病檢查。若按1%的患者接受膠囊式內(nèi)窺鏡檢查計(jì)算，國(guó)內(nèi)就已有近30億元的市場(chǎng)規(guī)模，前景很誘人。

膠囊式內(nèi)窺鏡制造基地已在杭州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)建成，一期工程將形成年產(chǎn)智能膠囊10萬(wàn)粒的產(chǎn)能。

（本刊訊）

Determination of the Content of Zotarolimus on the Drug Eluting Stents by HPLC

【W(wǎng)riters 】Li Yuan, Jiang Xi, Fan Bo, Cui Hong Tianjin Supervision and Testing Center for Medical Devices, 300191

HPLC, drug stent, zotarolimus, content determination

TH781

B

10.3969/j.issn.1671-7104.2011.02.017

1671-7104(2011)02-0134-03

2010-09-25

姜熙，E-mail: jiangxi8305@126.com

【 Abstract 】ObjectTo establish a method for the content determination of zotarolimus on the durg eluting stents.MethodsHPLC analysis was carried out with Zorbax Eclipse C8 colum(4.6×75 mm 3.5 μm)and MPA acetate buffer solution: acetonitrile (51:49), MPB acetate buffer solution: acetonitrile(5:95)as the mobile phase. The detection wavelength was 278 nm.ResultThere was a good linear relationship between the concentration of zotarolimus and the areas in the range of 5 μg/ml～75 μg/ml (r=0.99986). The average recovery was 101.58% with RSD 0.68%(n=6).ConclusionThe method is simple, accurate and reproducible. It can be used as the quality test for zotarolimus on the durg eluting stents.