許 濤 羅立強(qiáng)

1 (國(guó)家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心 北京 100037)

2 (中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院研究生部 北京 100037)

頭發(fā)是人體重要的生理代謝產(chǎn)物，發(fā)中金屬元素的含量和分布特征與人體血液濃度、生理代謝狀況等密切相關(guān)，在監(jiān)控和評(píng)價(jià)飲食[1]、環(huán)境暴露[2–4]、疾病[5]和藥物攝入[6]等引起的人體急慢性金屬中毒方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

礦山開(kāi)采中，因環(huán)境污染導(dǎo)致的人體急慢性鉛中毒，以及低水平的鉛污染中毒，對(duì)神經(jīng)、血液和消化系統(tǒng)，以及肝、腎等重要器官，都有不同程度的損害，如損傷兒童紅細(xì)胞中的DNA等[7]。目前，對(duì)人發(fā)中金屬元素的來(lái)源、元素與人發(fā)組織的結(jié)合機(jī)理與穩(wěn)定性等，尚缺乏充分認(rèn)識(shí)，阻礙了人發(fā)分析應(yīng)用的可靠性。對(duì)特定人發(fā)樣品中元素微區(qū)分析研究，有利于辨別人發(fā)中元素的來(lái)源和在人體中的生理代謝過(guò)程，對(duì)人發(fā)分析的正確應(yīng)用具有重要指導(dǎo)作用，為環(huán)境污染與人體健康關(guān)系研究提供參考。

同步輻射X射線熒光(SRXRF)微區(qū)分析具有高光強(qiáng)、微區(qū)、原位以及非破壞性等特點(diǎn)，同步輻射X射線具有單色性和可調(diào)性，與常規(guī)XRF分析技術(shù)相比，其信噪比低、光斑小、檢測(cè)限低，尤宜于微小樣品的高分辨率無(wú)損分析。本文利用SRXRF微區(qū)分析技術(shù)研究南京棲霞山鉛鋅礦區(qū)居民的單根人發(fā)樣品和發(fā)干切片組織，獲得它們的Pb、Fe、Cu、Zn元素相對(duì)強(qiáng)度分布特征，并討論了元素來(lái)源，以及與頭發(fā)組分的結(jié)合機(jī)理和有關(guān)代謝特征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品與準(zhǔn)備

2010年1月，采集了南京棲霞山鉛鋅礦區(qū)附近居民發(fā)樣，供樣者為女性，53歲，礦山退休鉗工，已在該礦區(qū)居住30年，血鉛濃度為35.02 mg/L，曾患急性腎盂腎炎，長(zhǎng)期有腰腿輕微疼痛癥狀。頭發(fā)未染色，采集腦后枕部帶毛囊組織的發(fā)樣。同時(shí)縱向分析另外3個(gè)居民的(56–67歲)單根發(fā)樣。

用IAEA推薦方法[8]清洗發(fā)樣。丙酮和去離子水(18 ?)超聲波清洗三次，每次10 min，再用25 mL丙酮超聲清洗10 min，以除去發(fā)樣表面的含金屬污染物。清洗后發(fā)樣置于60oC電熱板上充分干燥，以作發(fā)樣縱向SRXRF掃描，或切片SRXRF掃描。

清洗后發(fā)樣切片：剪取距發(fā)根1–1.5 cm處的5 mm樣品段置于包埋劑(OCT)中，在–22oC下，用切片機(jī)切取厚度約40 μm的垂直于發(fā)軸的薄片，每次切片前用酒精棉擦洗玻璃刀片。人發(fā)薄片吸附固定在 4.0 μm厚的光譜分析用聚丙烯薄膜(Chemplex)上，隨機(jī)挑選3個(gè)切片進(jìn)行元素掃描分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

發(fā)樣的縱向元素分布在北京同步輻射裝置(BSRF)的熒光站完成。分析環(huán)境為空氣，入射X射線能量15.53 keV, 光斑50 μm×50 μm，Si(Li)探測(cè)器采集元素?zé)晒庑盘?hào)。測(cè)試樣點(diǎn)測(cè)量時(shí)間為60 s, 樣點(diǎn)間距為0.5 mm。每個(gè)測(cè)試樣點(diǎn)均進(jìn)行重復(fù)測(cè)試。

橫向頭發(fā)切片的面掃描分析在上海光源(SSRF)硬X射線微聚焦線站(BL15U1)完成。分析環(huán)境為空氣，入射X射線由波蕩器產(chǎn)生，用Si(111)單色器選取15.95 keV的X射線(略高于Pb元素的L邊吸收能量15.87 keV)，經(jīng)K-B鏡聚焦2.5 μm×2.6 μm光斑；用硅飄移單元探測(cè)器(SDD, Vortex)采集元素的特征X射線線信號(hào)，用多道分析器記錄。切片面掃描時(shí)樣品點(diǎn)的測(cè)量時(shí)間為 1.5 s，圖像分辨率為 2 μm，樣品放置位置與入射X射線的夾角為45o，探測(cè)器水平方向與入射線夾角為90o。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 元素特征峰擬合

根據(jù)元素間Kα和Kβ特征譜線關(guān)系、入射X射線能量和元素峰位置，用 PyMCA軟件[9]標(biāo)定人發(fā)縱向樣品的X射線峰，設(shè)置拖尾峰、逃逸峰和脈沖堆積等參數(shù)，用軟件自帶線性多項(xiàng)式迭代程序作峰本底預(yù)估計(jì)，用Hypermet函數(shù)進(jìn)行譜峰擬合，完成重疊峰分解，同時(shí)扣除峰本底，獲得元素譜線凈峰面積。實(shí)驗(yàn)中特征峰擬合檢驗(yàn)誤差的χ2值均<3，擬合效果如圖1所示。

1.3.2 單根人發(fā)縱向分析

單根人發(fā)為圓柱或扁圓柱狀，粗細(xì)不均，則對(duì)入射X射線吸收不均。用元素峰凈面積對(duì)康普頓散射峰感興趣區(qū)(ROI)面積歸一，可減少樣品厚度變化對(duì)分析結(jié)果的影響。由于沒(méi)有用于微區(qū)分析的標(biāo)樣，樣品中元素的真實(shí)濃度難以計(jì)算，因此使用元素特征XRF峰相對(duì)計(jì)數(shù)強(qiáng)度表征元素相對(duì)強(qiáng)度。為對(duì)不同測(cè)試點(diǎn)元素的XRF譜進(jìn)行比較，將擬合后Pb的Lα和Lβ，F(xiàn)e、Cu、Zn的Kα和Kβ凈峰面積用康普頓散射峰ROI歸一，用歸一值表征元素相對(duì)強(qiáng)度。

用人發(fā)標(biāo)樣(GBW07601)監(jiān)控縱向分析，標(biāo)準(zhǔn)樣品為Φ10 mm×1 mm壓片。對(duì)人發(fā)標(biāo)樣作5次分析，每次采集兩個(gè)能譜，分析結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 2.38%，表明分析方法重現(xiàn)性較好。

圖1 人發(fā)樣品的SRXRF能譜及其PyMCA軟件擬合譜Fig.1 SRXRF spectrum of a human hair sample and the PyMCA-fitted spectrum.

1.3.3 人發(fā)橫向切片的掃描分析

采集Pb的Lβ、Fe、Cu、Zn的Kα射線計(jì)數(shù)，以及入射X射線電離室(I0)計(jì)數(shù)。選擇Pb的Lβ峰計(jì)數(shù)，是因?yàn)槠銵α(10.55 keV)峰與As的Kα(10.54 keV)的重疊；較小的X射線光斑掃描分析，空間分辨率穩(wěn)定，可降低元素譜線強(qiáng)度受樣品厚度變化的影響。用入射X射線電離室計(jì)數(shù)對(duì)元素特征射線計(jì)數(shù)強(qiáng)度進(jìn)行歸一，用歸一值表征元素相對(duì)強(qiáng)度，用作圖軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 橫向切片中元素相對(duì)強(qiáng)度

人發(fā)具有各種結(jié)構(gòu)形式。圖2為顯微鏡下頭發(fā)發(fā)干切面圖，人發(fā)直徑約80 μm，最外層為表皮薄層組織，中間是皮質(zhì)組織，中心是髓質(zhì)組織。微區(qū)分析表明，Cu和Zn在人發(fā)整個(gè)截面組織中接近均勻分布，Zn未見(jiàn)于表皮組織。Pb和Fe在人發(fā)皮質(zhì)組織中的相對(duì)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于在其它組織(圖3)， 少量分布在表皮組織，髓質(zhì)組織則幾乎無(wú)Pb、Fe。

研究表明，人發(fā)表皮細(xì)胞、中間皮質(zhì)組織微纖維結(jié)構(gòu)、內(nèi)部微纖維基質(zhì)、以及皮質(zhì)細(xì)胞核殘基，富含半胱氨酸、氨基和羧基化合物，對(duì)一、二價(jià)離子有不同的親和力[10–12]，可以與金屬陽(yáng)離子結(jié)合。另外，人發(fā)的細(xì)胞膜復(fù)合體中含有的游離脂肪酸也可與 Pb2+結(jié)合[13]。Pb、Fe、Cu、Zn在表皮、皮質(zhì)和髓質(zhì)組織中的相對(duì)強(qiáng)度分布特征不同，可能與頭發(fā)中的蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、黑色素[14]等主要成分分布、以及這些有機(jī)組分與金屬元素間親和力不同有關(guān)。

圖2 人發(fā)發(fā)干橫切面顯微圖Fig.2 Microscopic image of a cross-section of the hair shaft sample.

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cu、Zn在皮質(zhì)組織和髓質(zhì)組織中均以一定的相對(duì)強(qiáng)度分布，髓質(zhì)組織中的Cu、Zn相對(duì)強(qiáng)度比皮質(zhì)組織中略低。而以往研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Cu、Zn在髓質(zhì)組織中富集，原因在于研究的人發(fā)中不能確認(rèn)髓質(zhì)組織存在[15]，或者因?yàn)榉治鰞x器的靈敏度較低[16]。Cu、Zn在髓質(zhì)組織中富集可能與成熟髓質(zhì)組織中的毛透明蛋白[17]有關(guān)，反映了人發(fā)毛囊組織的活性。人發(fā)發(fā)育過(guò)程中，髓質(zhì)組織蛋白中的化學(xué)結(jié)合體變化程度較大[10]，如果Cu、Zn僅在人發(fā)發(fā)形成初期通過(guò)真皮突起中的血液供應(yīng)進(jìn)入人發(fā)，將不會(huì)出現(xiàn)在人發(fā)后期發(fā)育形成的變性髓質(zhì)組織中。高分辨率的同步輻射 XRF掃描圖證實(shí)了Cu、Zn存在于人發(fā)髓質(zhì)組織，表明毛囊組織活性在人發(fā)發(fā)育初期及其后較長(zhǎng)階段均較強(qiáng)，Cu、Zn可能參與了人發(fā)發(fā)育的全過(guò)程。

圖3 發(fā)干中元素的橫向分布特征圖(人發(fā)直徑約80 μm)Fig.3 Elemental mapping of a transverse section (～Φ 80 μm) of the hair shaft sample.

2.2 元素的縱向分布特征

清洗前后人發(fā)中元素相對(duì)強(qiáng)度變化的縱向分析結(jié)果見(jiàn)圖4，清洗后人發(fā)中Pb、Fe、Cu、Zn相對(duì)強(qiáng)度明顯降低。自發(fā)根起，清洗前后人發(fā)中各元素相對(duì)強(qiáng)度的比例均增大，表明人發(fā)污染隨人發(fā)與外部環(huán)境的接觸時(shí)間增加。在毛囊及發(fā)根(0–4 mm)附近的頭發(fā)中，清洗前后各元素相對(duì)強(qiáng)度的比例在 1附近波動(dòng)，表明毛囊及發(fā)根受外界污染很小。頭發(fā)中金屬元素多以與頭發(fā)中蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、黑色素等有機(jī)成分的結(jié)合態(tài)存在，IAEA推薦的清洗法可有效清除頭發(fā)表面吸附的污染物，但不影響與頭發(fā)中蛋白質(zhì)等組分結(jié)合的 Pb、Fe、Cu、Zn，清洗后頭發(fā)中元素縱向相對(duì)強(qiáng)度分布特征代表了元素的原始分布特征。

圖4 人發(fā)中Pb、Fe、Cu、Zn的縱向分析結(jié)果(自發(fā)根起)■ 清洗前，□ 清洗后Fig.4 Elemental mapping of Pb, Fe, Cu and Zn along the hair sample (from the hair root).■ Before washing, □ Washed

自毛囊起，清洗后Fe、Cu、Zn的相對(duì)強(qiáng)度穩(wěn)定，但 Pb變化較大。相似的元素縱向分布特征在其它3個(gè)發(fā)樣中均有發(fā)現(xiàn)。在靠近頭皮的毛囊和根部組織中，Pb相對(duì)強(qiáng)度最小，而距發(fā)根1 cm以上，發(fā)Pb相對(duì)強(qiáng)度明顯增加。其它3個(gè)發(fā)樣毛囊、 4 mm和 12 mm測(cè)試位點(diǎn)發(fā) Pb縱向相對(duì)強(qiáng)度分別為1.0–1.5，7.2–8.8和 10.6–63.1。表明毛囊和根部的Pb主要為內(nèi)源代謝來(lái)源的Pb，外源性來(lái)源的Pb對(duì)頭發(fā)根部組織的影響較小。離發(fā)根較遠(yuǎn)部位的 Pb相對(duì)強(qiáng)度較高，且有隨距離增加的趨勢(shì)。Kempson等[15]對(duì)吸附在頭發(fā)表面的Pb進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Pb呈擴(kuò)散分布特征，表明降落在頭發(fā)表面的外源 Pb容易與頭發(fā)組分結(jié)合。Martin等[18]利用SXRF微區(qū)分析技術(shù)對(duì)鉛冶煉工人單根發(fā)樣分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)根中Pb含量最低，靠近發(fā)梢發(fā)Pb含量增加，認(rèn)為發(fā)Pb具有內(nèi)源性和外源污染來(lái)源特征。南京棲霞山鉛鋅礦開(kāi)采產(chǎn)生的廢水、廢渣和大氣沉降，使礦區(qū)及附近土壤富集Pb、Zn、Cu等元素，礦山和附近菜園土壤中，Pb、Zn、Cu含量分別達(dá)3 128.87、2 872.48、201.83 mg·kg–1和637.15、684.91、74.48 mg·kg–1[19]，來(lái)自大氣沉降等外源性的 Pb成為該礦區(qū)附近居民發(fā)Pb相對(duì)強(qiáng)度高的一個(gè)重要原因，居民發(fā)Pb相對(duì)強(qiáng)度與礦區(qū)環(huán)境污染暴露相關(guān)。

以往研究[20]認(rèn)為Fe主要結(jié)合在人發(fā)根鞘組織，而非毛囊球部組織。Kempson[15]用 SRXRF研究煉鉛工人頭發(fā)中元素分布，發(fā)現(xiàn)Fe集中分布在人發(fā)末端表皮組織，根部組織沒(méi)有Fe，認(rèn)為Fe源于外界環(huán)境污染。而該礦區(qū)附近居民頭發(fā)毛囊組織中 Fe以較高相對(duì)強(qiáng)度分布，表明 Fe與體內(nèi)血液供應(yīng)有關(guān)。另外3個(gè)發(fā)樣毛囊、4 mm和12 mm測(cè)試位點(diǎn)發(fā) Fe縱向相對(duì)強(qiáng)度分別為 1.0–1.2，1.6–2.5和1.9–2.2。發(fā)干中Fe的縱向相對(duì)強(qiáng)度分布穩(wěn)定，在皮質(zhì)組織中呈較高相對(duì)強(qiáng)度分布特征，表明Fe與人發(fā)組織結(jié)合緊密，受環(huán)境暴露等因素的影響較小，為內(nèi)源性來(lái)源。

Cu、Zn在人發(fā)形成和生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的生理作用，影響著頭發(fā)生成組織的新陳代謝過(guò)程，Cu有將半胱氨酸氧化成胱氨酸的作用，細(xì)胞分裂與蛋白質(zhì)的代謝主要依賴于 Zn的作用，毛囊和根部組織中Cu、Zn以較高相對(duì)強(qiáng)度分布。其它3個(gè)發(fā)樣毛囊、4 mm和12 mm測(cè)試位點(diǎn)發(fā)Cu的縱向相對(duì)強(qiáng)度分別為2.0–2.7，2.4–2.7和2.2–4.1；Zn的縱向相對(duì)強(qiáng)度分別為 58.7–99.7，49.8–111.6和 46.7–111.5，單個(gè)發(fā)樣中Zn相對(duì)強(qiáng)度變化較小?？紤]到實(shí)驗(yàn)誤差的影響，清洗后的Cu、Zn縱向相對(duì)強(qiáng)度整體分布穩(wěn)定，相似的 Zn縱向分布特征在文獻(xiàn)[16]、[18]中也有報(bào)道，認(rèn)為Cu、Zn不受環(huán)境積累或消除作用的影響，為內(nèi)源性來(lái)源。

3 結(jié)語(yǔ)

用同步輻射X射線熒光法研究了鉛鋅礦區(qū)居民發(fā)樣中Pb、Fe、Cu和Zn微區(qū)分布特征。結(jié)果表明，棲霞山鉛鋅礦區(qū)居民發(fā)樣中金屬元素的縱向和橫向分布規(guī)律與人發(fā)中的蛋白質(zhì)等主要有機(jī)成分的分布特征、外源污染接觸狀況有關(guān)。外源性 Pb構(gòu)成居民發(fā)Pb的主要來(lái)源，F(xiàn)e、Cu和Zn為內(nèi)源性生理代謝來(lái)源。SRXRF微區(qū)分析研究礦區(qū)居民發(fā)樣分布特征,可為礦山環(huán)境污染過(guò)程與人體健康關(guān)系研究提供新證據(jù)。

致謝 衷心感謝上海光源和北京同步輻射裝置工作人員給予本工作的熱忱幫助。

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