劉 慧 汪 冰 王 卓 李 明 康艷杰,3秘曉林 余笑寒 豐偉悅

1 (中國科學(xué)院高能物理研究所納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和核分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100049)

2 (煙臺(tái)大學(xué)環(huán)境與材料工程學(xué)院 煙臺(tái) 264005)

3 (鄭州大學(xué)化學(xué)系 鄭州 450001)

4 (中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 上海 201800)

納米材料因其小尺寸效應(yīng)而易穿過各種生物體屏障(如血肺屏障、血腦屏障、皮膚屏障等)，對(duì)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等造成影響[1,2]。胎盤屏障是母嬰重要屏障，能防御外來有害物質(zhì)進(jìn)入胚胎，保證胎兒在母體內(nèi)正常發(fā)育。納米材料跨越胎盤屏障的能力、對(duì)胚胎早期的組織分化、發(fā)育和子代未來健康的潛在影響，是納米安全性研究的重要內(nèi)容，受到廣泛關(guān)注[3,4]。最近，Bai等[5]報(bào)道碳納米管暴露對(duì)雄性小鼠的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響，引起了人們對(duì)納米材料生殖系統(tǒng)安全性研究的重視，但目前有關(guān)納米材料是否能通過母體轉(zhuǎn)運(yùn)至胚胎還所知甚少。

量子點(diǎn)是新興的熒光標(biāo)記材料，與傳統(tǒng)有機(jī)染料和熒光蛋白相比，其熒光強(qiáng)度高、抗光漂白能力強(qiáng)和發(fā)射光譜窄[6]，在活細(xì)胞熒光標(biāo)記、腫瘤細(xì)胞示蹤、組織成像及動(dòng)物活體成像等生物領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景[7?9]。隨著量子點(diǎn)的廣泛應(yīng)用，其生物安全性問題引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注[10]。

果蠅體型小，生長周期短(10天左右一代)，繁殖效率高、胚胎發(fā)育速度快、能完全變態(tài)發(fā)育，是發(fā)育生物學(xué)研究的重要模式生物[11?14]。Liu等[12]研究了碳納米管對(duì)果蠅存活率和運(yùn)動(dòng)行為的影響，發(fā)現(xiàn)成蟲直接暴露于碳納米管粉末后，運(yùn)動(dòng)能力下降且死亡率上升。

目前，檢測(cè)量子點(diǎn)在活體組織及細(xì)胞內(nèi)定位的手段主要有激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)、多光子顯微鏡、核磁共振等[15?17]。但是，利用LSCM檢測(cè)量子點(diǎn)在生物體內(nèi)分布還存在一定困難，如檢測(cè)時(shí)通常會(huì)受到生物體自發(fā)熒光的干擾及生物體大小的限制(可適用于數(shù)μm的活體生物)；多光子顯微鏡分辨率略低，且費(fèi)用昂貴。同步輻射微束X射線熒光分析(μ-SRXRF)具有檢出限低(50–100 ng/g)、空間分辨率高(0.5–1 μm)及多元素檢測(cè)等特點(diǎn)[18]。目前已用于納米毒理學(xué)研究領(lǐng)域。Wang等[19]研究了Fe2O3納米顆粒經(jīng)嗅神經(jīng)通路向腦組織中的轉(zhuǎn)移，Gao等[20]研究了銅納米顆粒在線蟲體內(nèi)的分布。

本文利用μ-SRXRF技術(shù)結(jié)合LSCM技術(shù)研究了果蠅成蟲攝取量子點(diǎn)后，在暴露成蟲和子代一期幼蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布，測(cè)定了成蟲體內(nèi)的 Cd、Zn、Se元素，并對(duì)暴露成蟲所產(chǎn)的一期幼蟲進(jìn)行LSCM成像分析，探討量子點(diǎn)從果蠅母體轉(zhuǎn)運(yùn)到子代的能力。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

激光掃描共聚焦顯微鏡(美國PerkinElmer有限公司)；熒光倒置顯微鏡(Olympus IX71, 美國Olympus有限公司)；高功率數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500KDE, 昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(Acculab ALC-210.4, 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；渦旋儀(CS-H1型，北京博勵(lì)陽科技公司)；移液器(P型, 北京吉爾森科技有限公司)；Milli-Q Integral 3水純化系統(tǒng)；CdSe@ZnS納米粉體，尺寸3 nm，購于天津游瑞量子點(diǎn)有限公司；動(dòng)物為w1118突變體果蠅。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 染毒培養(yǎng)基的制備

稱取一定量的 CdSe@ZnS量子點(diǎn)配制成濃度為100 μg·g–1的水溶液，超聲分散1–2 h。取果蠅標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基1.8 g于空的玻璃管中，微波爐高火加熱10 s后迅速加入超聲好的 CdSe@ZnS量子點(diǎn)母液200 μL，渦旋混勻，制備成含有10 μg·g–1量子點(diǎn)的果蠅培養(yǎng)基，室溫冷卻后備用。

1.2.2 μ-SRXRF分析

收集新生未交配的雌、雄性果蠅各100只，分別暴露于含有10 μg·g–1CdSe@ZnS的培養(yǎng)基中，置于25oC的恒溫培養(yǎng)箱中(濕度為40%–60%、光照周期L:D = 14:10)，暴露5天。結(jié)束后收集果蠅成蟲，置于CO2環(huán)境中將其麻醉，用超純水多次清洗，用毛刷將其放到聚碳酸酯膜上(Maylar)，經(jīng)液氮冷凍后，室溫自然晾干，待μ-SRXRF分析用。

μ-SRXRF測(cè)量在上海光源BL15U實(shí)驗(yàn)站(中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所)上進(jìn)行。儲(chǔ)存環(huán)電子束流能量3.5 GeV，最大束流強(qiáng)度300 mA，利用該實(shí)驗(yàn)站的10 keV單色X射線，光斑尺寸10 μm×10 μm，果蠅成蟲掃描步長為20 μm×100 μm，單點(diǎn)掃描時(shí)間15 s。XRF能譜分析用Igor Pro 6.0軟件包(美國Wave metrics公司)，所得各元素的特征X射線強(qiáng)度用康普頓散射強(qiáng)度歸一，以消除樣品厚度、樣品不均勻性及光強(qiáng)變化等因素對(duì)計(jì)數(shù)的影響。

1.2.3 激光掃描共聚焦實(shí)驗(yàn)

果蠅暴露結(jié)束后，把雌雄果蠅轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中，進(jìn)行交配試驗(yàn)。收集交配后所產(chǎn)子一代一期幼蟲，用超純水清洗，放在薄的蓋玻片上，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdSe@ZnS量子點(diǎn)的熒光譜

圖1(a)為粒徑 3 nm的CdSe@ZnS量子點(diǎn)的熒光顯微譜，激發(fā)光為波長390 nm的紫外光，產(chǎn)生較強(qiáng)的綠色熒光，熒光峰值波長為520 nm，發(fā)射峰的半峰寬為33 nm，熒光強(qiáng)度高達(dá)2838。由圖1(b)，CdSe@ZnS量子點(diǎn)顆粒為圓形，尺寸均一，并發(fā)出明亮的熒光，與其熒光光譜圖相符。

圖1 390 nm UV激發(fā)下CdSe@ZnS量子點(diǎn)(3 nm)熒光光譜圖(a)和熒光顯微鏡照片(b)Fig.1 Fluorescence spectrum(a) and fluorescence image (b) of 3 nm CdSe@ZnS QDs under 390 nm UV.

2.2 CdSe@ZnS量子點(diǎn)的成蟲體內(nèi)分布

圖2為暴露于CdSe@ZnS量子點(diǎn)的果蠅成蟲體內(nèi)的Cd、Se和Zn 微區(qū)分布。Cd、Se、Zn均富集于成蟲尾部的腸道和生殖系統(tǒng)，這三種元素的共位性表明CdSe@ZnS量子點(diǎn)蓄積在這些部位。

2.3 CdSe@ZnS量子點(diǎn)經(jīng)母體向子代的轉(zhuǎn)運(yùn)

圖3為果蠅成蟲攝取CdSe@ZnS量子點(diǎn)后，所產(chǎn)子代一期幼蟲的LSCM成像圖片。由圖3(b)可見，果蠅成蟲暴露量子點(diǎn)后，其一期幼蟲體內(nèi)可檢測(cè)到明顯的熒光；比較圖 3(a)和3(c)，發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)主要富集于幼蟲生殖系統(tǒng)(精巢)內(nèi)。然而在未暴露量子點(diǎn)的空白對(duì)照組中，所產(chǎn)一期幼蟲在激光掃描共聚焦顯微鏡下未觀察到明顯的熒光信號(hào)，表明CdSe@ZnS量子點(diǎn)能通過果蠅母體轉(zhuǎn)運(yùn)至子代。

圖2 暴露于CdSe@ZnS量子點(diǎn)的果蠅成蟲體內(nèi)Cd、Se和Zn微區(qū)分布，由μ-SRXRF測(cè)得Fig.2 μ-SRXRF elemental mapping of Cd, Se and Zn in the CdSe@ZnS QDs-exposed adult drosophila.

圖3 LSCM成像觀察量子點(diǎn)在果蠅一期幼蟲體內(nèi)的分布(a) 一期幼蟲的明場(chǎng)照片, (b) 一期幼蟲的熒光照片, (c) 一期幼蟲的結(jié)構(gòu)圖Fig.3 LSCM images of stage-1 larva produced by the CdSe@ZnS QDs-exposed drosophila parents.(a) light field image, (b) fluorescence image, (c) structure of the stage-1 larva

3 結(jié)語

利用μ-SRXRF結(jié)合LSCM成像技術(shù)研究了經(jīng)口暴露的 CdSe@ZnS量子點(diǎn)在果蠅成蟲及子代一期幼蟲體內(nèi)的微區(qū)分布。μ-SRXRF分析表明，果蠅成蟲攝取CdSe@ZnS量子點(diǎn)后，量子點(diǎn)主要富集在腸道和生殖道部位。LSCM研究表明，暴露成蟲所產(chǎn)一期幼蟲的生殖部位(精巢)有明顯的熒光增強(qiáng)信號(hào)。上述結(jié)果表明，量子點(diǎn)暴露對(duì)果蠅母體到子代的轉(zhuǎn)運(yùn)及生殖系統(tǒng)可能產(chǎn)生潛在的影響。同時(shí)，μ-SRXRF技術(shù)的應(yīng)用也為納米顆粒在活體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供了很好的分析手段。

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