王燁軍，徐奕鼎，方吳云，夏先江

（安徽省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，祁門 245600）

茶樹無性系后代抗性生理因子的差異研究

王燁軍，徐奕鼎，方吳云，夏先江

（安徽省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，祁門 245600）

以自然生長狀態(tài)下的三年生鳧早二號新梢和迎霜、龍井43的留養(yǎng)秋梢茶樹葉片為供試材料，通過對茶樹無性系后代單株間抗性生理因子的差異分析及其在不同部位的分布規(guī)律研究，結(jié)果表明：隨葉位變化，SOD活性總體呈上升趨勢，隨著葉齡增加，增長幅度減緩，活性也漸趨于穩(wěn)定，且茶樹無性系后代單株間，SOD、POD、MDA和電導率的差異不顯著，個別甚至達到了極不顯著水平；對于試驗時的取樣部位，考慮到修剪、采摘、病蟲害、光線、溫度等因素影響，建議選用木質(zhì)化部位的成熟葉葉片，以減少實驗誤差。

茶樹；無性系；抗性；生理因子；酶

葉片的保護性酶活性、組織結(jié)構(gòu)特征、質(zhì)膜相對透性、可溶性糖含量以及自由水和束縛水含量等各項生理指標，通常作為茶樹脅迫抗性的啟動因子或表達因子而存在，與茶樹脅迫抗性密切相關(guān)。近年來，眾多科研工作者以盆栽茶苗為試驗材料，采用人工調(diào)控的方法對茶樹抗脅迫能力進行了大量研究，取得了一定進展。然而盆栽茶苗受取樣部位及葉片數(shù)量的限制，難以滿足多項檢測內(nèi)容和持續(xù)的實驗研究?？紤]到茶樹無性系后代能保持母本的性狀，具有整齊劃一的特點，因而以自然生長的茶樹為對象，通過對不同葉位及單株間葉片的抗性生理指標的測定，旨在探明茶樹無性系后代抗性生理因子的表達差異，探討茶樹抗性研究時以自然生長茶樹葉片作為分析材料的可行性及最佳的取樣部位。

1 材料與方法

1.1 供試茶園及品種

單株間生理生化指標差異分析：選用安徽省農(nóng)科院茶葉研究所品種園自然生長狀態(tài)下的三年生鳧早二號；不同葉位生理生化指標差異分析：選用祁門縣厲口鎮(zhèn)留養(yǎng)秋梢的平地茶園，供試品種為迎霜和龍井43。

1.2 取樣時間及方法

2010年5月18日上午8點，隨機選取鳧早二號茶樹5株，每株取芽下第4片葉進行不同單株間生理生化指標差異分析；2010年6月1日上午8點30分，隨機選取留養(yǎng)秋梢的3個迎霜枝條和2個龍井43枝條，取成熟葉片第3、第5、第7、第9和第11位葉片進行不同葉位間生理生化指標差異分析。取材時選擇無病蟲害、生長情況、著生方向基本一致的枝條。取樣后，立即裝入塑料袋內(nèi)封口，貯于底部置有冰塊的保溫箱內(nèi)，作為供試材料。

1.3 實驗樣品制備

1.3.1 酶液制備

稱取洗凈、擦干，去主脈的半邊茶樹葉片0.5 g（做葉位檢測時取0.2 g），剪碎。加入2mL預(yù)冷的0.1mol/L的磷酸緩沖液（SOD酶磷緩pH為7.8，POD酶磷緩pH為7.0）和少許石英砂及適量不溶性吡咯烷酮，冰浴中迅速研磨成漿，再加3mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液分次沖洗研缽，洗液轉(zhuǎn)入10mL離心管中，在4℃條件下以4500r/min離心10min，上清液在相同條件下二次離心后用于相關(guān)內(nèi)容檢測。

1.3.2 丙二醛的提取

稱取洗凈、擦干，去主脈的半邊茶樹葉片0.2 g，剪碎，加入少量石英砂和10%三氯乙酸2mL，研磨至勻漿，再加10%三氯乙酸8mL進一步研磨，勻漿在4℃條件下，以4500r/min離心10min，其上清液在相同條件下二次離心后用于檢測。

1.4 檢測方法

過氧化物酶(POD) 活性測定參考愈創(chuàng)木酚法[1]，略有改動。于試管中加入0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）2.9mL、0.3%愈創(chuàng)木酚1.0mL、0.3%過氧化氫1mL、酶提取液0.1mL，用磷酸緩沖液作空白。在37℃水浴中準確保溫15min，立即取出并加入10%三氯乙酸2.0 mL終止反應(yīng)。然后用1cm比色皿于470nm波長處，測吸光值E470。

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參考氮藍四唑（NBT）法[2]；按表1加入各反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的溶液作空白，在560nm波長下測定各管的消光值。

表1 加入反應(yīng)液用量

細胞質(zhì)外滲率采用電導率法[3]，略有改動。選取的葉片用蒸餾水沖洗兩次，并用潔凈濾紙吸干。用直徑0.5cm的打孔器避開葉片主脈打取D=0.5cm圓形葉片。稱取0.2g樣品放入20mL具塞刻度試管中，加入10mL蒸餾水，振蕩2h后靜置1h，用電導儀測定初電導值(S1)。測畢，將各試管蓋塞封口，置沸水浴中10min，殺死組織細胞。取出冷卻，在室溫下平衡10min，搖勻，測其終電導值(S2)。蒸餾水電導率值（S0）為空白。根據(jù)L=S1-S0/S2-S0，計算相對電導度(L)。

茶樹葉片丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法[4]，略有改動。于試管中加入提取液2mL，對照管加蒸餾水2mL，然后各管再加入4mL0.6%硫代巴比妥酸溶液。搖勻，混合液在沸水浴中反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液分別在532、600和450nm波長下測定吸光度（A）值。

氣溫用溫度計測定，葉溫利用紅外溫度測定儀測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Word 和SPSS軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

迎霜和龍井43茶樹葉片中SOD酶活性測定結(jié)果見表2。

2.1 不同葉位茶樹葉片中SOD酶活性的變化趨勢

圖1 不同葉位SOD酶活性趨勢圖

表2 不同枝條不同葉位的迎霜和龍井43茶樹葉片中SOD酶活性測定結(jié)果（單位：U/g）

在逆境發(fā)生時，SOD活性的增加可有效地清除過多的自由基而抑制過氧化作用,從而減輕或避免凍害的發(fā)生。低溫能增加植物體內(nèi)活性氧的含量，降低SOD活性，加強膜脂氧化作用。大量的研究認為，SOD活性與植物的抗脅迫能力強弱有很大的關(guān)系。本次實驗由圖1可知：各葉位間活性有一定差異，尤其以第3位葉與其他葉位差異顯著，隨葉位變化，活性總體呈上升趨勢，隨著葉齡增加，增長幅度減緩，活性也漸趨于穩(wěn)定。由圖2隨機取樣檢測結(jié)果方差分析表明：對于不同枝條而言，各葉位間SOD酶活性非常接近，尤其以第3、第9和第11位葉片活性最為穩(wěn)定，顯著性差異不顯著；第5、第7葉位差異稍大。

圖2 不同枝條葉位間SOD酶活性差異顯著性分析

2.2 不同單株間生理指標差異分析

3年生鳧早2號芽下第3位葉生理指標測定結(jié)果見表3。

表3 鳧早2號不同單株間茶樹葉片的生理指標測定結(jié)果

由表3知：在同一氣溫條件下，茶樹葉片溫度表現(xiàn)不一，但差距不大。各溫度下的茶樹生理因子并沒有呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化?？梢姡⑷醯臏囟茸兓?，或者說在某一正常范圍內(nèi)的溫度變化，不足以引起茶樹生理指標的變化；第4位葉片的SOD酶活性、POD酶活性、電解質(zhì)外滲率、MDA含量整體表現(xiàn)相對來說還是比較穩(wěn)定，尤其以兩種酶活性穩(wěn)定性為最，鳧早二號無性系后代間的生理指標差異并不顯著。

2.3不同品種間生理生化指標差異分析

圖3 不同品種間SOD酶活性

對不同品種（迎霜和龍井43）SOD活性的測定結(jié)果(圖3)表明，迎霜SOD酶活性與龍井43酶活性相比，整體不在一個層次上，處于相同小氣候條件，相同管理水平下，相同葉位的迎霜品種的SOD酶活性要比龍井43的SOD酶活性高。經(jīng)方差分析（圖2），迎霜SOD活性與龍井43 SOD活性差異達到極顯著水平。這表明SOD酶活性除了受各種環(huán)境因子及葉齡的影響外，還與茶樹本身的種性有密切關(guān)系。在逆境脅迫時SOD活性的高低不但可作為茶樹抗性的鑒定指標，還可以作為種性的鑒定指標。

3 討論

茶樹生長發(fā)育過程中，各種酶等生理因子的活力與分布是不同的，茶樹在代謝過程中，包括了種類繁多的酶或多酶體系的催化過程，它們在茶樹體內(nèi)的形成、激活或阻遏，受到茶樹的遺傳信息和環(huán)境因子等協(xié)調(diào)作用，這些多酶體系一旦發(fā)生折散或逆變，則茶樹機體就會失去活性。因而研究茶樹的抗性生理對茶樹抗性育種、茶樹資源抗性鑒定、抗性種質(zhì)材料的篩選及建立茶樹遭受脅迫的預(yù)警與調(diào)控機制都具有重要作用。近年來，為了提高種質(zhì)鑒定評價的效果和效率，在鑒定評價方法的標準化、核心種質(zhì)構(gòu)建和分子標記技術(shù)的應(yīng)用研究上雖然取得了較大進展，但許多基礎(chǔ)理論需要進一步深入研究。

3.1 茶樹無性系后代抗性生理因子的差異表達

茶樹在進化過程中，形成了一套保護自身免受自由基損傷的系統(tǒng)，其中包括超氧化物歧化酶和過氧化物酶，它們是許多小分子的自由基清除劑，通常被作為植物抗逆性的生理鑒定指標而在逆境生理研究中得到廣泛應(yīng)用。有關(guān)抗性生理因子在茶樹不同部位中的分布，前人做過大量研究。段亮[5]研究表明：由“幼葉—成葉—老葉”,可溶性蛋白質(zhì)含量按“中—高—低“的方式變化,MDA含量按“低—中—高”的方式變化,SOD 活性按“低—高—低”的方式變化;葉綠素含量和 CAT 活性在由“成葉—老葉”的變化過程中,按“高—低”的方式變化,而由“幼葉—成葉”的變化不顯著或顯著性差異程度低。本實驗表明：隨葉位變化，SOD活性總體呈上升趨勢，隨著葉齡增加，增長幅度減緩，活性也漸趨于穩(wěn)定。然而有關(guān)茶樹無性系后代間抗性生理因子的差異研究卻鮮見報道。由圖2知：自然生長狀態(tài)下，茶樹無性系后代單株間，相同葉位的抗性生理因子差異并不顯著，個別甚至達到了極不顯著水平，這表明茶樹無性系后代不但能繼承母本的形態(tài)特征，保持整齊劃一的特點，在生理生化特性方面，本質(zhì)上也具有一致性。若取樣方法選擇得當，則田間的隨機取樣，可以代表該茶樹的整體性狀。

3.2 取樣部位的選擇

目前，有關(guān)茶樹生理生化分析還沒有統(tǒng)一的取樣部位。羅軍武，唐和平，黃意歡[6]在研究茶樹不同抗寒性品種間保護酶類活性的差異時，選用的是成齡茶樹的成熟春葉(自上至下第二葉)；王玉，洪永聰，丁兆堂等[7]在利用茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)指數(shù)預(yù)測茶樹種質(zhì)材料的抗寒性研究中采用的是枝條頂端以下第二張成熟葉片；而魏鵬[8]在研究茶樹抗旱性部分生理生化指標時候采用的則是生長高度相近的新梢芽下第2葉和第3葉。本研究表明：茶樹抗性生理指標在茶樹葉片中的分布以第3、第11位最為穩(wěn)定，自第7位葉以后酶活性基本維持在一定水平。然而茶樹是多年生作物，各種生理指標與外界環(huán)境因素及栽培條件和管理水平密切相關(guān)。修剪、采摘、病蟲害、光線、溫度等都會對茶樹生理生化因子造成一定的影響。龔志華，黃意歡，羅軍武等[9]研究結(jié)果表明：重修剪對衰老茶樹的保護酶活性影響較大，重修剪后茶樹SOD活性提高，CAT活性下降，重修剪處理與對照的酶活性差異達到極顯著水平(P0.01)。此外，由于茶樹本身具有的品種差異性，因而取樣部位是否具有良好的代表性，在很大程度上決定了茶樹生理檢測的準確性?？紤]到外界因子的影響，因而建議取樣時盡量選用木質(zhì)化部位、同一方向、相對完整的成熟葉葉片，以減少實驗誤差。

[1] 商業(yè)部茶葉畜產(chǎn)局,商業(yè)部杭州茶葉加工研究所編著.茶葉品質(zhì)理化分析[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社，1989:476～477.

[2] 王學奎主編.植物生理生化實驗原理和技術(shù)（第2版）[M].北京:高等教育出版社，2006：172～173.

[3] 鄒琦主編.植物生理學實驗指導[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[4] 周祖富,黎兆安主編.植物生理學實驗指導[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005.

[5] 段亮.茶樹葉片的衰老與保護酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的關(guān)系[J].茶葉科學技術(shù)，1990, (3)：24～26.

[6] 羅軍武,唐和平,黃意歡. 茶樹不同抗寒性品種間保護酶類活性的差異[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版), 2001, 27(2):94～96.

[7] 王玉,洪永聰,丁兆堂,等. 利用茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)指數(shù)預(yù)測茶樹種質(zhì)材料的抗寒性[J]. 中國農(nóng)學通報, 2009, 25(9):126～130.

[8] 魏鵬．茶樹抗旱性部分生理生化指標的研究[D]．重慶：西南農(nóng)業(yè)大學，2003．

[9] 龔志華,黃意歡,羅軍武,等.重修剪對衰老茶樹保護酶影響的研究[J].茶葉科學，2002,(2)：152～155.

S571.1

A

1006-5768(2011)01-0007-05

2010-07-26

王燁軍（1976- ），男，安徽石臺人，助理研究員，主要從事茶葉生化和育種方面研究。

安徽省農(nóng)業(yè)科學院院長創(chuàng)新基金“溫度脅迫下茶樹抗性響應(yīng)機制研究”（10E1301）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助。