毛理納,劉 娜,羅 予

(1.河南職工醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系,河南鄭州 451191; 2.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院,河南鄭州 450052)

金黃色葡萄球菌為臨床常見致病菌,隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的檢出率也逐年增高,國內(nèi)近年來報道的MRSA分離率也在60%～70%[1]。MRSA菌株具有多重耐藥性,它對現(xiàn)今所有的β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥,目前臨床上治療MRSA感染的首選藥是萬古霉素、替考拉寧等糖肽類抗生素[2]。替考拉寧對 MRSA的治療作用比萬古霉素強大,不良反應(yīng)少于萬古霉素且與氨基糖苷類聯(lián)用對腎功能損害較輕微。該文探討替考拉寧對MRSA和敏感葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)臨床分離株的體外抗菌活性,為臨床治療金黃色葡萄球菌尤其是MRSA的感染,提供用藥及耐藥監(jiān)測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床感染標本分離得到,且不重復(fù)的 18株金黃色葡萄球菌,質(zhì)控標準菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923。

1.1.2 藥品 替考拉寧(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠,批號:090203)。

1.1.3 PCR試劑盒 天根生化科技有限公司。

1.1.4 MH肉湯 北京三藥科技開發(fā)公司,批號: 0810282。藥敏紙片:北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 mecA基因PCR檢測 引物序列如下[3]: P1:5'-TGGCTATCGTGTCACAATCG-3',P2:5'-CTGGAACTTGTTGAGCAGAG-3'。由寶生物工程有限公司合成。

PCR擴增片段長度為310 bp。采用煮沸法提取基因組DNA,PCR反應(yīng)總體系為50 ul,PCR反應(yīng)條件:94℃變性3 min;PCR循環(huán)(94℃50 s,55℃50 s,72℃70 s,32個循環(huán)),72℃延伸 5min。然后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳,進行擴增產(chǎn)物鑒定。

1.2.2 臨床菌株的頭孢西丁紙片法檢測MRSA

按照K-B紙片擴散法進行,根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷細菌的耐藥情況。根據(jù)2006年NCCLS判定標準判定[4]:MRSA抑菌環(huán)直徑≤19 mm,MSSA抑菌環(huán)直徑≥20mm。

1.2.3 替考拉寧對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性 瓊脂稀釋法:將已倍比稀釋的不同濃度替考拉寧溶液分別加入已加熱溶解并在 50℃水浴中平衡的MH瓊脂中,充分混勻后傾入滅菌平皿中,按(藥物∶瓊脂=1∶9)比例配制藥物瓊脂平板。

菌液制備與接種:取過夜培養(yǎng)各菌株增菌液用無菌生理鹽水稀釋 100倍,調(diào)整菌含量為每毫升106個細菌,備用。

用接種器吸取制備好的菌液約 2μl接種于含藥瓊脂平板表面,置 37℃孵育 24 h,觀察結(jié)果。根據(jù)2006年NCCLS判定標準判定:耐藥菌MIC≥32 mg·L-1,敏感菌MIC≤8mg·L-1。

2 結(jié)果

2.1 mecA基因PCR檢測結(jié)果 18株金黃色葡萄球菌臨床分離株中9株檢出mecA基因,為MRSA陽性,陽性率為50%,9株未檢出mecA基因。見圖1和 2。

2.2 頭孢西丁紙片法檢測結(jié)果 9株MRSA的抑菌環(huán)直徑均小于19mm。余9株菌的抑菌環(huán)直徑均大于20mm,為MSSA。

2.3 替考拉寧對MRSA/MSSA體外MIC測定結(jié)果替考拉寧對金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC為0.125 mg·L-1,對9株MRSA的MIC在1～2 mg·L-1,對9株MSSA的MIC在0.125～0.25 mg·L-1。對替考拉寧均為敏感。

3 討論

替考拉寧對MRSA和MSSA的藥敏結(jié)果顯示,替考拉寧對二者均有良好的抗菌活性,但MRSA的MIC大于MSSA的MIC,最低抑菌濃度均在有效濃度范圍之內(nèi),可以作為MRSA感染的治療藥物。近年來,隨著抗生素及糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用,細菌耐藥問題日益嚴重。據(jù)文獻報道,90%以上的葡萄球菌(SA)可產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶使青霉素類抗生素水解失活,表現(xiàn)為耐藥。1961年英國報道了首例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)以來,迅速在全球范圍內(nèi)播散,其所致的醫(yī)院感染率逐漸上升,并開始向社區(qū)播散,成為全球關(guān)注的嚴重感染疾病[5]。本文中,18株金黃色葡萄球菌中9株為MRSA,MRSA的分離率為50%。MRSA從未知宿主中獲得一種MecA基因,編碼產(chǎn)生新的PBPs,即PBP2a。PBP2a為一種轉(zhuǎn)肽酶,對抗菌藥親和力低,能代替PBPs繼續(xù)肽聚糖合成以維持SA的生長、成活,表現(xiàn)為高度耐藥。MRSA幾乎是多重耐藥菌,對所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥,甚至累及到紅霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素。目前MRSA僅對糖肽類(萬古霉素、替考拉寧)抗生素和某些新研制的抗菌藥如唑烷酮類(利奈唑胺)敏感 。

替考拉寧在臨床上主要用于治療各種革蘭陽性菌引起的嚴重感染,尤其對MRSA引起感染的治療作用比萬古霉素更強大,嚴重不良反應(yīng)罕見,除靜脈給藥外也可進行肌內(nèi)注射等優(yōu)點。該實驗通過替考拉寧對金黃色葡萄球菌體外抗菌活性研究,為臨床治療MRSA感染性疾病提供用藥及耐藥監(jiān)測依據(jù)。

[1] 董 燕,王仙園,周 紅,等.中草藥對MRSA臨床株的抑菌作用研究[J].護理研究,2008,22(4):863-865.

[2] Lowy FD.StaphyLococcus intecLions[J].NEng LMed,1998,339 (8):520-532.

[3] 樊 新,岳喬紅,楊 柳,等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MecA基因的鑒定分析 [J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2007,22 (6):66-67.

[4] Clinical and Laboratoty Standards Institute.Perfor2mance standards for antimicrobial suscep tibility testing[S].M1002S15, CLSI,2006.

[5] Enng MC,Robinson DA,Randle G,etal.The evolutionary history ofmethicillin resistant staphylococcus aureus(MRSA)[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(11):7 687-7 692.