龐麗萍 張文麗 馮 佳 徐海嬋 許 蕾 張 倩 孫麗華 孟慶祥

北京大學(xué)深圳醫(yī)院血液科，廣東 深圳 518036

近年來，在鑒定急性髓性白血病（AML）獲得性分子標(biāo)志方面已有很大進(jìn)步，而且這可能對現(xiàn)在使用的依據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)行的危險分層增加一些新的信息，特別是為成年人核型正常的AML的治療及預(yù)后評估提供一個新的因素。國外自2000年以來已開展了這方面的實(shí)驗(yàn)室檢測及臨床工作，我國剛剛起步?，F(xiàn)將本人2008年以來做的關(guān)于FLT3在AML中的表達(dá)及臨床意義的工作做一總結(jié)報(bào)告，以利于同行間進(jìn)行交流。

1 資料方法

1.1 研究對象 選取2008年1月以來我科診治的急性髓性白血病（AML）患者50例， 男29例，女21例，中位年齡28.5歲。核型正常的AML患者20例，核型異常的AML患者30例，M1 5例，M2 10例，M3 10例，M4 9例，MDS相關(guān)的AML 10例，M5 5例，M6 1例。全部病例經(jīng)臨床、骨髓細(xì)胞學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、染色體核型分析及融合基因檢測確診，符合MICM的診斷分型標(biāo)準(zhǔn)。全部病例在病程中均無白血病中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵犯。發(fā)病時外周血白細(xì)胞3.6-310×10 9/L（中位數(shù)21.2×10 9/L），血紅蛋白53-89g/L（中位數(shù)71 g/L），血小板計(jì)數(shù)10.0-250.0×10 9/L（中位數(shù)35×10 9/L）。骨髓細(xì)胞學(xué)檢查：有核細(xì)胞增生活躍一極度活躍，原始粒細(xì)胞50-90.5%，異常早幼粒細(xì)胞30-81.5%。心電圖、胸片、肝功、腎功檢查均未見異常。、

1.2 研究方法 所有患者化療前抽取骨髓3ml，用PCR方法檢測白血病細(xì)胞FLT3的表達(dá)情況，具體實(shí)驗(yàn)如下：

方法：2.1.1 基因組DNA的制備 采集患者新鮮骨髓標(biāo)本2mlL，采用Roche DNA Isolation Kit for Mammalian Blood試劑盒提取血液基因組DNA?；蚪MDNA經(jīng)nanodrop測量含量后，將其置于-20℃冷凍。

2.1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBand中的FLT3基因序列，利用DNA star軟件設(shè)計(jì)對應(yīng)于14號外顯子近端和15號外顯子遠(yuǎn)端的保守序列引物，14F：GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3;15R: CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3。擴(kuò)增區(qū)域包含整個JM區(qū)和一部分TK-1區(qū)域。引物由TaKaRa公司合成（PAGE純化），純水稀釋分裝，保存于-20℃。

表1 ：50例AML患者FLT3檢測情況

表2 ：有無FLT3表達(dá)對AML DFS、OS的影響

表3 ：FAB各亞型AML的FLT3表達(dá)情況

表4 ：骨髓白血病細(xì)胞比例與FLT3的表達(dá)

2.1.3 PCR擴(kuò)增 PCR儀是美國ABI 9700型。PCR反應(yīng)體系采用promega公司的Master mix試劑，引物濃度為500nM，DNA模板量為50ng。循環(huán)條件為：95℃ 10min；95℃30 sec;56℃30sec;72℃45sec，35個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電冰，用SABY GREEN染色觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13。0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)和X2檢驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 50例AML患者9例FLT3檢測陽性，占18%。見表一至表四。

2 討 論

FLT3是細(xì)胞因子受體之一的似fms的酪氨酸 激酶3（fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)LT3），在早期干細(xì)胞的生存和髓系分化起重要作用，此蛋白高表達(dá)于急性髓性白血病中，且與核型正常成人急性髓性白血病的治療預(yù)后有關(guān)[2][4]。

為了更精確核型正常的急性髓性白血病的危險分層，使更多的此類患者得到更合理，更有效的治療[1][4]。筆者申報(bào)深圳市科技局課題一項(xiàng)，題目：急性髓性白血病FLT3檢測及臨床意義，旨在為深圳市急性髓性白血病的診斷、治療做些工作。本研究的目的探討FLT3的表達(dá)與急性髓性白血病臨床特征的關(guān)系，為臨床診斷、預(yù)后判斷及分子靶向治療提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果提示50例急性髓性白血病患者9例檢測出FLT3的表達(dá)陽性率為18%，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的檢測結(jié)果類似[3]。進(jìn)一步核染色體核型的不同分組檢測，發(fā)現(xiàn)核型異常的AML的FLT3表達(dá)率明顯高于核型正常的AML FLT3表達(dá)率，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。復(fù)發(fā)難治AMLFLT3表達(dá)率明顯高于持續(xù)緩解的AML FLT3表達(dá)率，二者差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05，此結(jié)果為核型正常的AML的危險分層增加了一個新的信息[5][6]。

本研究的單因素分析顯示：發(fā)病年齡大于50歲，初診WBC>30.0×10 9/L，骨髓白血病細(xì)胞比例＞50%，有FLT3表達(dá)，是AML總體生存的不利影響因素，（P＜0.05）。伴有附加染色體異常是AML患者無病存活的唯一不利因素(P<0.05) 。進(jìn)一步的分析表明有FLT3表達(dá)的AML 5年DFS和OS明顯低于無FLT3表達(dá)的AML，二者差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5][6]。

FLT3的表達(dá)在AML FAB各亞型的分布無差異(P> 0.05)。

總之，AML中FLT3的表達(dá)率占18%，F(xiàn)LT3的表達(dá)是AML患者一個較常見的分子遺傳學(xué)異常，有FLT3表達(dá)的AML有特異的臨床特征:如 5年DFS OS低，骨髓白血病細(xì)胞比例高，外周血白細(xì)胞高等。因此，F(xiàn)LT3的檢測可考慮做為AML患者的臨床輔助檢測方法，用于指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。

1,郭鵬翔 ,郭曉麗 ,徐方明，漿細(xì)胞白血病--5例報(bào)告及與多發(fā)性骨髓瘤比較[J] 罕少疾病雜志，2003, 10(4).

2.李云,劉勝全,閆呈新，白血病肺浸潤的CT表現(xiàn)[J]中國CT和MRI雜志，2009, 7(4).

2.Rosemary E.Gale,Glaire Green,Christopher Allen et al.The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level, number,size,and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult patients witn acute myeloid leukemia.Blood,1 march 2008.volume 111,number 5 P2776-2783.

3.Susan P.Whitman,Amy S.Ruppert,Michael D.Radmacher et al. FLT3 D 835/1836 mutations are associated with poor diseasefree survival and a distinct gene-expression signature among younger adults with de novo cytogenetically normal acute myeloid leukemia lacking FLT3 internal tandem duplications.Blood,1 february 2008.volume111,number3 P1552-1558.

4.Sridhar vempati,Carola Reindl,Seshu Kumar Kaza et al. Arginine 595 is duplicated in patients with acrte leukemias carrying internal tandem duplications of FLt3 and modulates its transforming potential.Blood,15 july 2007.volume 110, number 2 P686-693

5.Sasanne Schnittger,Claudia Schoch,Martin Dugas et.Analysis of FLT3 length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia:correlation to cytogenetics,FAB subtype, and prognosis in the AMLCG study and usefulness as amarker for the detection of minimal residual disease.Blood,1 july 2002.volume 100,number 1 P59-65.

6.Christian thiede,Christine Steudel,Brigitte Mohr,Markus Schaich at al.Analysis of FLT3-activting mutations in 979 patiens with acute myelogenous leukemia:association with FAB subtupes and identification fo subgroups with poor prognosis .Blood,15 june 2002.volume 99,number 12 P4326-4334.