劉紅霞 馮國開 杜 靜 郭曉華 黃巧冰

南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理教研室

RhoA-ROCK介導的Moesin磷酸化對晚期糖基化終產(chǎn)物誘導的內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能改變的調(diào)節(jié)作用

劉紅霞 馮國開 杜 靜 郭曉華 黃巧冰

南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理教研室

目的：驗證Rho A／ROCK信號通路參與晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）引起的膜突蛋白（Moesin）磷酸化，ROCK通過與Moesin直接作用導致Moesin磷酸化，探討AGE引起Moesin磷酸化的位點及其生物學效應(yīng)。方法：選用Rho A顯性負效突變體（Rho AN19）和組成型活性突變體（Rho AL63）的重組腺病毒感染細胞，應(yīng)用G-LISA試劑盒及免疫印跡法檢測Rho A活性及ROCK、Moesin磷酸化水平，并采用ROCK抑制劑處理細胞，明確Rho A／ROCK通路是否參與AGE介導的Moesin磷酸化；通過免疫共沉淀方法檢測ROCK與Moesin的相互作用，了解ROCK引起Moesin磷酸化的方式；通過分子克隆及體外定點突變技術(shù)構(gòu)建Moesin的真核表達質(zhì)粒pcDNA3／HA-Moesin及其突變體pcDNA3／HA-Moesin T558A 和pcDNA3／HA-Moesin T558D，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，運用免疫印跡、單層內(nèi)皮細胞通透性測定及內(nèi)皮細胞骨架纖維狀肌動蛋白（F-actin）形態(tài)和定位檢測，查明在AGEs誘導下的Moesin磷酸化位點。結(jié)果：AGE以時間和劑量依賴方式引起內(nèi)皮細胞Rho A活性增高，改變Rho A活性，可以影響ROCK及Moesin的磷酸化水平；使用ROCK抑制劑，可減少Moesin磷酸化。ROCK通過直接與Moesin相互作用，導致Moesin磷酸化。用丙氨酸替代Moesin的558位蘇氨酸抑制型突變體（pcDNA3-HA-Moesin T558A）可以降低AGEs引起的Moesin磷酸化水平、內(nèi)皮細胞通透性，并改善AGEs引起的F-actin重排。而用天冬氨酸替代558位蘇氨酸的激活型突變體（pc DNA3-HA-Moesin T558D）可以模擬AGEs引起的Moesin磷酸化水平、內(nèi)皮細胞通透性及F—actin重排。結(jié)論：AGE通過激活Rho A活性進而導致其下游靶分子ROCK磷酸化，并通過直接與Moesin蛋白相互作用導致其磷酸化激活，進而引起內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的改變。AGE引起Moesin蛋白活化的位點為第558位蘇氨酸磷酸化位點（T558），抑制T558位點磷酸化可改善AGEs誘導的內(nèi)皮細胞形態(tài)與功能的改變。

本課題為國家自然科學基金No.30771028；教育部創(chuàng)新團隊項目No.IRT0730