付 強(qiáng)，祁巖超*，唐純志，劉振寰，林世堅，唐鴻生

（ 1.廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院實驗中心，廣東 廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，廣東 廣州 510405；3.佛山市南海區(qū)婦幼保健院，廣東 佛山 528200）

腦性癱瘓（cerebral palsy，CP）是小兒先天性或圍產(chǎn)期所發(fā)生的腦功能障礙性綜合征，是繼脊髓灰質(zhì)炎被控制后近代最常見的兒童致殘性疾病[1]。針刺作為中醫(yī)治療中的一枝奇葩在治療小兒腦癱方面有著不錯療效[2]。但完全治愈率僅5%左右。本實驗通過針刺和神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合治療腦癱幼鼠，以探討其協(xié)同作用對其學(xué)習(xí)記憶能力和腦內(nèi)神經(jīng)再生的療效，最大限度地改善其學(xué)習(xí)記憶能力和肢體運動能力。為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基和B27（GIBCO）公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic f broblast growth fact，b FGF）、表皮生長因子（epidermal growth fact，EGF）（GIBCO）。溫室一/二抗（自配）。主要儀器有：G6805-1電針治療儀（中國青島鑫升實業(yè)有限公司），Y迷宮（河南省原陽縣振華教育儀器廠），BX50生物組織顯微鏡（Olympus），免疫熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2 實驗動物及分組

清潔級健康新生SD幼鼠40只（體質(zhì)量＞12 g），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)選取8只作為正常對照組（正常組）；成功模型隨機(jī)分成以下3組，每組8只：模型組、單純針刺組、腦癱+NSC移植治療組。

1.3 方法

1.3.1 HIBD動物模型制作參照文獻(xiàn)[4]用乙醚淺麻醉幼鼠，分離左頸總動脈并結(jié)扎（模型組、治療組），縫合切口后放入37℃恒溫水浴容器中恢復(fù)2 h，然后密閉容器，以1 L/min的速度通入8%氧氣+92%氮氣的混合氣體，2.5 h后取出，1 h后作行為測定。翻身不能，平衡異常和左旋者視為成功模型，并返回鼠籠中飼養(yǎng)。

1.3.2 針刺部位：參考《實驗針灸學(xué)》[5]，結(jié)合人與動物骨類比，選取百會，顳1針，曲池，內(nèi)關(guān)，足三里，涌泉。 方法：以直徑0.2 mm，長20 mm的華佗牌針刺針，頭部穴位平刺，進(jìn)針后覺針下沉緊即可，百會、顳1針接G6805-II電針儀，連續(xù)波，頻率5～10 Hz，以頭部輕微抖動為度，約3～5 V，持續(xù)10 min。曲池，足三里穴針1分針深左右，電針同上。內(nèi)關(guān)、涌泉速刺微出血，不留針。每天一次，共21 d。

1.3.3 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定參照宣愛國等的培養(yǎng)實驗方法[6]取新生SD大鼠（＜24 h），在無菌條件下分離出海馬，制成單細(xì)胞懸液，加入含B27、表皮生長因子（EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（FGF-2）的DMEM/F12培養(yǎng)基。鏡下觀察，待原代克隆形成后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。以后每5～7 d分離克隆傳代1次，方法同前。神經(jīng)干細(xì)胞鑒定細(xì)胞過程：培養(yǎng)的干細(xì)胞加入包被POLYL-Lycine的6孔板，PBS洗2次，10 min/次。4%多聚甲醛固定20 min。0.01mPBS洗2次，每次5 min。0.01 mPBS+0.2% tritonx-100穿透30 min。0.3%～0.5%二抗宿主血清（山羊血清）封閉60 min。室溫一抗（nestin 1︰500；GFAP 1︰500，Tuj-1 1︰100，O4 1︰200分孔加入6孔板）孵育2 h，或4℃過夜，濕盒保溫。0.01 mPBS+0.2% tritonx-100或PBS洗滌3次，每次3 min。室溫二抗生物素標(biāo)記物（或FITC標(biāo)記山羊抗小鼠）孵育60 min（1︰200）用濕盒保存，此時避光操作。0.01 PBS洗滌3次，每次10 min。用DAPI（一種熒光染料，呈藍(lán)色）或heochst染核10～30 min。0.01 PBS洗滌10 min 1次。用緩沖甘油封片，熒光或共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.4 海馬組織病理形態(tài)學(xué)檢測（HE染色法）組織經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)包埋，石蠟切片4 UM，二甲苯兩缸脫蠟各6 min，無水乙醇洗脫二甲苯1 min χ2次，95%、90%、85%酒精各1 min，自來水漂洗2 min，蒸餾水浸洗1 min，蘇木精染色3～5 min。自來水洗1 min。1%鹽酸酒精分化3 s。自來水洗1 min。1%稀氨水返藍(lán)30 s后，鏡下控制。自來水洗1 min。伊紅染色1 min。自來水沖30 s。85%酒精脫水30 s。90%酒精脫水30 s。95%酒精兩次脫水各2 min。無水乙醇兩次各2 min。二甲苯三次各2 min。中性樹膠封片。普通光鏡10×20倍下隨機(jī)觀察每張切片5個不同視野內(nèi)腦缺血后病理變化情況，并計數(shù)正常神經(jīng)比較低數(shù)目，取平均值。

1.3.5 腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL法）幼鼠腦組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚4μ m。切片經(jīng)純二甲苯脫臘二次，每次6分鐘。梯度乙醇脫二甲苯各2 min。自來水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min，切片浸入0.1% Triton×100液室溫下處理8 min。流水沖洗2 min，入PBS洗1 min，3次。滴加轉(zhuǎn)換液37℃處理30 min。入PBS洗2 min，3次。BCIP-NBT顯色液鏡下控制顯色約10 min，流水沖洗3 min，入PBS洗2 min，3次。擦去組織周圍水分，GVA水溶性封片劑封片，室溫晾干。每張切片在10×20倍光鏡下隨機(jī)觀察每一組動物同一部位切片，選擇5個不重復(fù)視野進(jìn)行觀察，并聯(lián)接圖像分析系統(tǒng)，測出每張切片5個不重復(fù)視野內(nèi)全部正常神經(jīng)細(xì)胞及凋亡神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目，取其平均值，算出凋亡指數(shù)。

1.3.6 細(xì)胞移植 將以上培養(yǎng)的NSC神經(jīng)球吹打成單個細(xì)胞，反復(fù)清洗后調(diào)細(xì)胞濃度為1×108，取2 μL，細(xì)胞為2×105。在日光燈照射下通過尾靜脈注射。隔天1次，共3周。

1.3.7 行為學(xué)實驗：（1）懸吊實驗 使幼鼠前腿抓住一水平的不銹鋼棒（直徑約5 mm）。離地面高約45 cm，以秒為計算單位，記錄幼鼠掉下的時間。時間越短說明肌力越好。（2）斜坡實驗，將幼鼠頭向下倒置于45℃斜面上，記錄幼鼠轉(zhuǎn)為頭向上135℃角度的時間，以秒為計算單位，記錄時間。時間越短說明隨意運動越好。（3）Y迷宮實驗電壓50 V～60 V，試驗前先將幼鼠放入迷宮中適應(yīng)3～5 min，然后以無規(guī)則次序變換安全區(qū)。幼鼠受電擊后逃到安全區(qū)后，燈光繼續(xù)作用10～15 s。再以幼鼠所在支臂就作為下一次測試的起始位置進(jìn)行下一次測試。記錄幼鼠從打開燈到逃到安全區(qū)所需時間。凡幼鼠受電擊后10 s內(nèi)一次性從起步逃到安全區(qū)的反應(yīng)稱為“正確反應(yīng)”，否則為“錯誤反應(yīng)”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測

2.1.1 懸吊實驗結(jié)果（表1）。

表1 懸吊實驗結(jié)果

表1 懸吊實驗結(jié)果

注：各組與模型組相比★P＜0.01；針刺+NSC組與單純針刺組相比▲P =0.027＜0.01。

實驗分組 n 術(shù)后24 d正常組 8 59.27±1.58★模型組 8 26.19±13.61單純針刺組 8 131.2±11.79★針刺+NSC組 8 40.54±10.65★▲

2.1.2 斜坡實驗結(jié)果（表2）。

表2 各組幼鼠斜坡實驗結(jié)果 （

表2 各組幼鼠斜坡實驗結(jié)果 （

注：各組與模型組相比★P＜0.01。

正常組 8 12.29±1.25★模型組 8 25.57±7.12單純針刺組 8 19.31±8.25★針刺+NSC組 8 17.89±6.21★

2.1.3 Y迷宮實驗結(jié)果（表3）。實驗分組 n 正確次數(shù)

表3 各組幼鼠術(shù)后24 d Y迷宮試驗正確次數(shù) （，秒）

表3 各組幼鼠術(shù)后24 d Y迷宮試驗正確次數(shù) （，秒）

注：各組與模型組相比★P＜0.01；針刺+NSC組與單純針刺組相比▲P =0.015＜0.01。

正常組 8 19.27±1.13★模型組 8 19.15±2.15單純針刺組 8 13.16±1.32★針刺+NSC組 8 16.26±1.41★▲

2.2 組織學(xué)檢測

2.2.1 腦內(nèi)海馬組織正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目（表4）。

表4 各組幼鼠海馬組織正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目（個/視野）

表4 各組幼鼠海馬組織正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目（個/視野）

注：各組與模型組相比★P＜0.01；針刺+NSC組與單純針刺組相比▲P =0.007＜0.01。

實驗分組 n 正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)正常組 8 21.69±1.75★模型組 8 11.37±0.82單純針刺組 8 15.38±1.26★針刺+NSC組 8 17.15±1.22★▲

2.2.2 腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（見表5）。

注：凋亡指數(shù)（apoptosis index, AI）是指每張TUNEL陽性切片中，選取5個陽性細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者）最多的高倍視野，計算其中陽性細(xì)胞所占的百分比。

表5 各組幼鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（，%）

表5 各組幼鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（，%）

注：各組與模型組相比★P＜0.01；針刺+NSC組與單純針刺組相比▲P=0.006＜0.01。

實驗分組 n 凋亡指數(shù)正常組 8 10.89±0.15★模型組 8 17.82±1.13單純針刺組 8 14.36±2.35★針刺+NSC組 8 11.79±1.43★▲

腦組織涂片：普通光鏡10×20倍下隨機(jī)觀察每張腦組織切片病理形態(tài)學(xué)變化情況：腦組織常規(guī)石蠟切片，HE染色后，神經(jīng)細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色。（1）正常組皮層腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)無水腫表現(xiàn)，胞漿豐富，胞核清晰可見，海馬錐體細(xì)胞2～3層，而且相鄰細(xì)胞間排列緊密，核仁清晰，細(xì)胞核圓而大。（2）模型組可見皮層變薄，部分神經(jīng)元變性，體積變小，核固縮成三角形或不規(guī)則形，核仁消失，胞核與胞漿界限模糊。海馬錐體細(xì)胞層數(shù)減少，排列稀疏，不規(guī)則，細(xì)胞體積變小，可見核固縮現(xiàn)象。（3）單純針刺組、針刺+NSC組仍有不同程度的神經(jīng)細(xì)胞變性，但變性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，零星可見一些損傷細(xì)胞，海馬錐體細(xì)胞層細(xì)胞形態(tài)、排列基本正常。

3 討論

針灸治療腦癱已經(jīng)得到國內(nèi)外學(xué)者的共識，但其機(jī)制尚不清楚，可能是通過針刺的良性誘導(dǎo)，促進(jìn)了一系列細(xì)胞因子的產(chǎn)生與釋放，從而改善了NSC所賴以生存的腦內(nèi)微環(huán)境并進(jìn)一步促進(jìn)NSC增殖與定向分化，最終達(dá)到修復(fù)腦癱腦損傷的目的[7]。因此，可以認(rèn)為針刺是促進(jìn)了腦內(nèi)源性NSC的增殖和分化。但僅內(nèi)源性NSC不足以修復(fù)損傷的腦組織，外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植可解決這一難題，但仍存在較大的局限性，主要是轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的比率低，療效欠佳[7]。如果有針刺的干預(yù)，可能會使其整合到相應(yīng)腦區(qū)繼續(xù)發(fā)揮作用。隨著對小兒腦癱研究的不斷深入，CP的治療手段逐漸增多。神經(jīng)干細(xì)胞移植治療小兒腦癱成為目前的一種新的治療方向。本研究中我們將祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)精華-針灸療法加以改進(jìn)，用現(xiàn)代神經(jīng)干細(xì)胞技術(shù)，移植足量的NSC到SVZ區(qū)，即解決了針炙促進(jìn)SVZ區(qū)NSC增殖數(shù)量有限的難題。又使外源性NSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的效率盡可能得到提高。最終使腦癱治療的有效率和治愈率提高。本實驗研究結(jié)果證實，針刺和神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植對腦癱幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、肢體運動能力以及腦組織細(xì)胞數(shù)量的維持和抑制凋亡均有顯著效果。

[1] 王維治.神經(jīng)病學(xué)(第5版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:279.

[2] 鐘玉濤,李勝吾.針刺治療小兒腦癱近況概述[J].吉林中醫(yī)藥, 2010,30(5).

[3] SnyderEY,YoonC,Flax JD,et a1.Muhipotent neural precursors Call differentiate to ward replacement of neurous undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,9:I1 663-11 668.

[4] 張 敏,楊萬章,吳 芳,等.神經(jīng)生長因子配合臍血源神經(jīng)干細(xì)胞移植對腦癱患兒運動功能的影響[J].中國誤診學(xué)雜志,2008,8(23):5 596-5 598.

[5] 余曙光,郭 義.實驗針灸學(xué)[M].上?？萍汲霭嫔?2009,1,1.

[6] 宣愛國,龍大宏,楊丹迪,等.神經(jīng)干細(xì)胞和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)用對癡呆模型鼠基底前腦p75表達(dá)及其學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].解剖學(xué)雜志,2007,30(1):43-45.

[7] 劉 鄉(xiāng),柴鐵劬,孫 娟,等.靳三針療法對窒息腦癱幼鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化的實驗研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2010:231-235.