陳福艷,陳明,黃婷,張彬,楊家堅(jiān),雷愛瑩,王瑞,梁萬文

(廣西水產(chǎn)研究所,廣西南寧530021)

六須鯰暴發(fā)性敗血癥病原菌的分離與鑒定

陳福艷,陳明,黃婷,張彬,楊家堅(jiān),雷愛瑩,王瑞,梁萬文

(廣西水產(chǎn)研究所,廣西南寧530021)

從患暴發(fā)性敗血癥的六須鯰Silurus soldatovi身上分離到致病菌株(FY-024),用常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法對(duì)其觀察,并進(jìn)行生理生化特性測試。結(jié)果表明,該致病菌均符合鯰愛德華氏菌Edwardsiella ictaluri特征。為了進(jìn)一步確認(rèn)該致病菌的分類地位,對(duì)其進(jìn)行了16S rRNA基因序列分析、遺傳距離距陣及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,共擴(kuò)增出1 417 bp基因片段(GenBank登錄號(hào)為GQ924477)。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示,菌株FY-024與鯰愛德華氏菌的16S rRNA基因同源性達(dá)99.6%～99.9%,聚為同一分支,進(jìn)一步確認(rèn)致病菌是鯰愛德華氏菌。藥敏試驗(yàn)和毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株FY-024對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星藥物高度敏感,按Reed和Muench氏法計(jì)算LD50=1.08×106cfu/尾。

六須鯰;鯰愛德華氏菌;暴發(fā)性敗血癥;分離與鑒定

六須鯰Silurus soldatovi原產(chǎn)于黑龍江流域,廣西水產(chǎn)研究所于2007年引進(jìn)六須鯰。馴養(yǎng)與繁殖結(jié)果表明,該魚雖為北方品種,但同樣適應(yīng)中國南方地區(qū)的養(yǎng)殖環(huán)境條件,生長速度甚至比原產(chǎn)地提高50%以上,當(dāng)年苗種養(yǎng)殖60 d體重可達(dá)1.5 kg,養(yǎng)殖1周年體重可達(dá)10～13 kg。由于六須鯰生長快,出肉率高,無肌間刺,是魚片加工出口的上好材料,因而該魚有望成為未來5～10年內(nèi)中國產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖開發(fā)的主導(dǎo)品種之一,其養(yǎng)殖及加工開發(fā)前景非常廣闊[1-4]。

2009年6月,某養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的六須鯰暴發(fā)急性敗血癥。發(fā)病初期,魚不攝食,游動(dòng)緩慢,反應(yīng)遲頓,常靜臥,偶爾失去平衡;發(fā)病后期,體表潰瘍,頭部、背鰭及內(nèi)臟組織嚴(yán)重充血,腹部漲氣,腸套疊。病發(fā)3 d后魚開始死亡,5～6 d達(dá)到死亡高峰期,死亡率為60%。為了查明病原,作者對(duì)瀕臨死亡的病魚進(jìn)行病原菌分離、鑒定、生理生化特性及藥物敏感性研究,確定其致病原因,旨在為六須鯰養(yǎng)殖中的病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

感染試驗(yàn)用健康魚來源于廣西水產(chǎn)研究所那馬淡水養(yǎng)殖基地。將試驗(yàn)魚運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d,期間無病害發(fā)生。鯰愛德華氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株是由廣西水產(chǎn)研究所魚病防治研究室(以下簡稱為本研究室)分離保存的。

血平板購自鄭州安國綠科生物公司;TSA培養(yǎng)基按常規(guī)方法自配;藥敏紙片購于杭州天和試劑有限公司。光學(xué)顯微鏡(GX41型)購于寧波市江東歐億檢測儀器有限公司;PCR儀、核酸蛋白分析儀及凝膠成像儀均購于BIO公司;生化鑒定盒(MID-64、MID-65)購于廣東環(huán)凱公司,引物由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 觀察魚發(fā)病與死亡的情況,并分4次對(duì)23尾患病魚進(jìn)行體征觀察,確定病魚典型癥狀后,選取最為典型患病活魚進(jìn)行細(xì)菌分離,無菌接種肝、腎、腦組織于血平板,28℃下恒溫培養(yǎng)36～48 h后,挑取生長形態(tài)基本一致的單菌落于TSA液體中純化培養(yǎng)48 h,然后用體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油保存于冰箱(-85℃)中。

1.2.2 人工感染試驗(yàn) 為了確定臨床分離菌株的致病性,取純化細(xì)菌3 mL,以12 000 r/min離心5 min,棄上清液,再加等量無菌生理鹽水振蕩制成濃度為7.49×108cfu/mL(第1組)原液,并將原液稀釋成7.49×107cfu/mL(第2組)、7.49×106

cfu/mL(第3組)、7.49×105cfu/mL(第4組)。細(xì)菌感染試驗(yàn)設(shè)4組,每組10尾魚,分別取各濃度的菌液于腹鰭基部注射,劑量為0.1 mL/尾;對(duì)照組注射等量無菌生理鹽水。飼養(yǎng)水溫為27～30℃。感染試驗(yàn)中連續(xù)觀察7 d,記錄病魚癥狀及死亡數(shù)量,當(dāng)感染組出現(xiàn)典型癥狀時(shí),用上述細(xì)菌分離方法再次分離純化細(xì)菌。采用Reed-Muench氏法[5]計(jì)算細(xì)菌的半致死濃度(LD50)。

1.2.3 藥物敏感試驗(yàn) 按常規(guī)藥敏紙片法,將培養(yǎng)36 h的菌液稀釋100倍,均勻涂布于血平板,稍晾干,再將各種藥敏紙片貼上,于28℃下培養(yǎng)48 h,測定抑菌圈直徑。每種藥物作雙樣對(duì)照,取其平均值。

1.2.4 細(xì)菌分類鑒定

1)形態(tài)觀察 經(jīng)革蘭氏染色,在油鏡下觀察培養(yǎng)菌落的形態(tài)特征。

2)生化鑒定 將臨床分離菌株從冰箱中取出,用血平板復(fù)蘇,挑取單菌落用3 mL生理鹽水(0.75%)洗脫,加100 μL菌液到生化鑒定孔,置于恒溫箱(37℃)中培養(yǎng)36 h,統(tǒng)計(jì)生化反應(yīng)結(jié)果。具體操作方法按照環(huán)凱生化鑒定盒說明書進(jìn)行。同時(shí)將菌液涂布于血平板作生長對(duì)比。

3)PCR診斷 為了便于指導(dǎo)養(yǎng)殖戶及時(shí)科學(xué)用藥,采用本研究室建立的“鯰愛德華氏菌PCR快速診斷方法”[6]對(duì)初次分離純化后的致病菌進(jìn)行初診。

4)分子鑒定

(1)細(xì)菌DNA的制備 取臨床分離菌株接種于TSB培養(yǎng)基上,于28℃下振蕩培養(yǎng)36 h,取菌液1 mL,以4 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入雙蒸餾水100 μL,于100℃水浴中煮沸8 min,再以12 000 r/min離心5 min,取上清液作為PCR模板DNA[6-7]。

(2)16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及序列進(jìn)化分析PCR反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μL,dNTP(5 mmol/L)1 μL,引物各1 μL,模板1 μL,Taq酶0.5 μL,加ddH2O至50 μL。引物序列為:f D1,5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3';r D1,5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'。反應(yīng)程序?yàn)?94℃下預(yù)變性2 min;94℃下變性5 min,55℃下退火1 min,72℃下延伸1.5 min,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72℃下再延伸10 min,4℃下結(jié)束。樣品送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行16S rRNA基因序列測序。用DNAStar軟件構(gòu)建遺傳距離距陣和系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 病魚癥狀與體征

發(fā)病初期,六須鯰不進(jìn)食,游動(dòng)緩慢,反應(yīng)遲緩,常靜臥,時(shí)而失去平衡,時(shí)而向水面掙扎;病發(fā)后期,病魚體表嚴(yán)重出血,頭部、眼眶、吻端、鰭條基部及腸道出現(xiàn)點(diǎn)狀出血,部分病魚的腹部膨大,有淡黃色透明液體,肝胰臟腫大,腸套疊,頭頂(腦組織處)有白點(diǎn),胸部有輕度糜爛現(xiàn)象。病害發(fā)生7 d內(nèi)死亡率達(dá)60%,發(fā)病3～4 d達(dá)到死亡高峰期。六須鯰發(fā)病期間,養(yǎng)殖池塘中的水質(zhì)已經(jīng)惡化。

2.2 細(xì)菌的形態(tài)特征

從患病魚肝、腎、腦組織分離出菌落形態(tài)一致的細(xì)菌(編號(hào)FY-024),于血平板上和TSA培養(yǎng)基中生長良好。經(jīng)培養(yǎng)24～36 h后,菌落為乳白色,呈針尖大小,隆起,表面光滑,邊緣整齊,有黏性。

2.3 人工感染試驗(yàn)

從圖1可見:第1組,試驗(yàn)第1天死亡1尾,第3天達(dá)到死亡高峰,死亡率為90%,第4天死亡率為100%;第2組,試驗(yàn)第3天魚開始死亡,第4天達(dá)到死亡高峰,死亡率為90%,第6天死亡率為100%;第3組,試驗(yàn)魚從第4天開始死亡,第7天死亡率為40%;第4組及空白對(duì)照組的試驗(yàn)魚全部存活。采用Reed和Muench氏法計(jì)算出FY-024菌株對(duì)六須鯰的半數(shù)致死濃度(LD50)為1.08×106cfu/尾。

圖1 用FY-024菌株注射感染的試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Challenge test of the isolated strain FY-024 by injection

感染12 h后,第1組魚游動(dòng)緩慢,反應(yīng)遲緩,不進(jìn)食;剛死的魚頭部、鰭條基部、肛門等部位有

點(diǎn)狀出血點(diǎn),解剖腹部可見腸道嚴(yán)重出血,腸套疊。第3組病魚,后期頭頂(腦組織處)有白點(diǎn),胸部有輕度糜爛癥狀;從人工感染瀕死魚分離到的細(xì)菌與FY-024菌株基本一致?？膳袛郌Y-024菌株是本次六須鯰發(fā)病的致病菌。

2.4 生化鑒定

從表1可見:FY-024菌株的主要生化指標(biāo)與東秀株等[8]的結(jié)果一致,即為革蘭氏陰性桿菌,第一代有溶血,但傳代溶血性差甚至無溶血,試驗(yàn)無動(dòng)力,不產(chǎn)生硫化氫,V.P.陰性,無哚吲產(chǎn)生,不液化明膠,不利用丙二酸鹽、水楊素和檸檬酸鹽,T.D.A.陰性,氧化酶陰性,尿素酶陰性,精氨酸和鳥氨酸陰性,賴氨酸陽性,分解葡萄糖,不發(fā)酵蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、ONPG、棉子糖、木糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、肌醇和阿東醇。

訓(xùn)練的過程也是對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行參數(shù)尋優(yōu)的過程,目前常用的算法有:SGD、Adam、Adadelta、Adagrad、RMSprop等[18],本文選用隨機(jī)梯度下降法SGD進(jìn)行各層參數(shù)的尋優(yōu),其中涉及了幾個(gè)重要因素的選擇:批訓(xùn)練尺寸batch_size、迭代次數(shù)epochs、初始學(xué)習(xí)率η等.

表1 分離菌株的生化特性Tab.1 The biochemical characteristics of the isolated strain

綜合分析分離細(xì)菌(FY-024)的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性的試驗(yàn)結(jié)果和病魚臨床癥狀,初步認(rèn)為該致病菌是鯰愛德華氏菌Edwardsiella ictaluri。

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)

FY-024菌株對(duì)17種抗菌藥物的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表2。病原菌對(duì)環(huán)丙沙星(水產(chǎn)禁用藥)、恩諾沙星藥物高度敏感;對(duì)頭孢噻吩、菌必治、頭孢呋肟、先鋒V中度敏感;對(duì)羅紅霉素、克拉霉素、鏈霉素、卡那霉素、頭孢克洛、頭孢克肟、羧芐青霉素、慶大霉素、先鋒必、阿莫西林和利福平不敏感。

表2 分離菌株FY-024的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The sensitivity of the isolated strain FY-024 to chemotherapentants

2.6 PCR診斷

采用鯰愛德華氏菌PCR快速診斷方法進(jìn)行初診,經(jīng)PCR擴(kuò)增和凝膠成像系統(tǒng)觀察,結(jié)果見圖2,擴(kuò)增片段約276 bp,結(jié)果與鯰愛德華氏菌的特異性引物目的條帶[6]一致,因此,初步確定為鯰愛德華氏菌。

2.7 16S rRNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對(duì)FY-024菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行分析,擴(kuò)增出大小為1 417 bp的基因片段(GenBank登錄號(hào)為GQ924477)。將結(jié)果與GenBank中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)(圖3),發(fā)現(xiàn)與愛德華氏菌屬的鯰愛德華氏菌、?？茞鄣氯A氏菌E.hoshinae、遲緩

圖2 FY-024和鯰愛德華氏菌特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR amplification of the strain FY-024 and Edwardsiella ictaluri

圖3 菌株FY-024的16S rRNA基因序列同源矩陣Fig.3 Homology and genetic relationship of the strain FY-024

圖4 不同種類愛德華氏菌16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene from bacterial Edwardsiella species

3 討論

人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明,從自然發(fā)病六須鯰中分離到的FY-024菌對(duì)健康六須鯰具有較強(qiáng)的致病及致死作用,并且感染魚的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似,都出現(xiàn)體表、內(nèi)臟嚴(yán)重充血,腸道內(nèi)有黃色透明液體,肝脾臟腫大等現(xiàn)象。另外,從感染發(fā)病魚及死亡魚中均能分離到與FY-024菌株完全一致的細(xì)菌,這證明FY-024菌株對(duì)六須鯰有致病性。同時(shí),為了及時(shí)指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)有效地用藥,本研究室于第一時(shí)間采用PCR快速診斷方法對(duì)初次分離到的FY-024菌株進(jìn)行快速診斷,結(jié)果表明,FY-024菌株與鯰愛德華氏菌(本研究室保存)的電泳條帶相一致,約處于276 bp,因此初步定為鯰愛德華氏菌。為了進(jìn)一步確定病因,還采用生理生化指標(biāo)檢測和16S rRNA基因序列分析兩種方法對(duì)FY-024菌株進(jìn)行分類學(xué)鑒定,兩種方法的結(jié)果一致,進(jìn)一步確定本次分離到的致病菌為鯰愛德華氏菌。

六須鯰自然發(fā)病情況及人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明,此菌具有較強(qiáng)的致病性,病魚死亡率高,對(duì)六須鯰規(guī)?；B(yǎng)殖具有較大的危害。另外,本研究中還用FY-024細(xì)菌人工感染斑點(diǎn)叉尾鮰,注射劑量為7.49×106cfu/mL。結(jié)果表明:感染第2天,斑點(diǎn)叉尾鮰開始出現(xiàn)死亡,死亡率高達(dá)100%,感染組也出現(xiàn)與六須鯰自然發(fā)病相似的癥狀,但斑點(diǎn)叉尾鮰沒有腹部鼓起的癥狀。由此可見,本次分離菌株對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰也有一定的致病能力。據(jù)報(bào)道[6,9-12],鯰愛德華氏菌主要感染鯰形目的一些種

類,如斑點(diǎn)叉尾鮰、蟾胡子鯰和云斑鮰等。另外,也會(huì)感染一些非鯰形目魚類,如鰻鱺、大麻哈魚、羅非魚、鳙等。六須鯰屬于鯰愛德華氏菌易感染的魚類之一,但從六須鯰體內(nèi)分離到鯰愛德華氏菌尚屬國內(nèi)首例。本研究結(jié)果將為六須鯰規(guī)?；B(yǎng)殖中的病害防治提供有益的借鑒。

從本次發(fā)病情況看,六須鯰感染鯰愛德華氏菌后,發(fā)病快,傳染性強(qiáng),死亡率高。因此,在六須鯰養(yǎng)殖過程中,要做好鯰愛德華氏菌病的預(yù)防工作。主要有以下幾點(diǎn):1)水質(zhì)管理。放魚前做好場地消毒,可用30 g/m3生石灰?guī)逄粱蛴?～2 g/m3強(qiáng)氯精對(duì)水體消毒。養(yǎng)殖期間保持水質(zhì)清新,定期換水,無換水條件的池塘在發(fā)病高峰期(7—9月),每隔15～30 d用強(qiáng)氯精、二氧化氯或溴氯海因?qū)λw消毒,用藥一周后使用益生菌調(diào)節(jié)水質(zhì)。2)魚苗消毒。購進(jìn)魚苗或倒池時(shí),可用30 g/m3食鹽水或用10 g/m3高錳酸鉀浸泡魚苗5～10 min。倒池過程中若魚苗受傷嚴(yán)重,可對(duì)其外潑二氧化氯或強(qiáng)氯精消毒,內(nèi)服(拌飼)菌毒殺星或恩諾沙星。3)飼料管理。投鉺時(shí)需投喂鮮活飼料,不可投喂腐敗變質(zhì)飼料。如投喂水蚯蚓等動(dòng)物性飼料時(shí),可用30 g/m3食鹽水浸泡5～10 min后再投喂。4)定期預(yù)防。每隔20～30 d投喂魚病康或大蒜素,預(yù)防病害的發(fā)生。

致謝:本文得到楊學(xué)明博士悉心指導(dǎo),特此致謝!

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The isolation and identification of pathogen in northern sheatfish Silurus soldatovi suffering from fulminant septicaemia

CHEN Fu-yan,CHEN Ming,HUANG Ting,ZHANG Bin,YANG Jia-jian, LEI Ai-ying,WANG Rui,LIANG Wan-wen
(Guangxi Institute of Fisheries,Nanning 530021,China)

The bacteria strain FY-024 was isolated from northern sheatfish Silurus soldatovi suffering from fulminant septicaemia and identified by conventional tests of bacterial culture,and by physiological and biochemical characteristics.The results showed that the strain FY-024 was very likely to be Edwardsiella ictaluri.16S rRNA gene of the strain was amplified,and sequenced to investigate the phylogenetic position.A fragment of 16S rRNA gene consisting of 1 417 bp was obtained,sequenced and submitted to Genbank(Accession No.:GQ924477).Compared with that of other related bacterial species,molecular phylogenetic dendrogram was constructed according to the genetic distance.This strain was found to be shared 99.6%-99.9%of homoeology with Edwardsiella ictaluri and clustered into one clade in phylogenetic dendrogram,confirming that this strain being Edwardsiella ictaluri.In addition,the drug sensitivity showed that this strain had high sensitivity to Ciprofloxacin and Enrofloxacin,and the strain FY-024 had a LD50(50%lethal dose,LD50)of 1.08×106cfu per fish calculated by the method of Reed and Muench in the injection challenge test.

Silurus soldatovi;Edwardsiella ictaluri;fulminant septicaemia;isolation and identification

2095-1388(2011)01-0063-05

S943

A

2010-03-15

廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目(桂科基0731037,桂科合0718007B-34)

陳福艷(1979-),女,工程師。 通信作者:梁萬文(1961-),男,研究員。E-mail:nnlww@126.com