董 毅,朱太崗,張飛虎,葛 曦,湯繼春,李月紅,劉連成

肝硬化是臨床常見病、多發(fā)病,該病進入失代償期后逐漸發(fā)展,最終可能導致肝功能衰竭。雖然肝臟移植取得了一定的效果,可是供移植的肝臟來源有限,況且器官移植的費用之高也令患者望而卻步。目前臨床上主要仍以保肝對癥及預防并發(fā)癥為主,終末期肝病的治療總體效果不甚理想,因此尚需探討新的治療方法[1]。近年來骨髓干細胞移植治療已在醫(yī)學領域取得了令人矚目的成就,也為終末期肝病的治療提供了新方法,自體干細胞移植不存在免疫排斥及倫理問題,是一種具有廣闊應用前景的有效治療手段?，F(xiàn)將我院開展的自體外周血干細胞治療對肝硬化患者的肝纖維化改善情況作一分析報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇 2009年 9月～2010年 10月我院接受自體干細胞治療的肝硬化住院患者 35例,男 25例,女 10例,年齡 24～63歲,中位年齡 51歲。其中肝炎后肝硬化 30例,酒精性肝硬化4例,血吸蟲性肝硬化1例,肝功能Child-Pugh A級5例,B級 20例,C級 10例,患者治療前均明確診斷肝硬化[2]。設常規(guī)治療的肝硬化患者 20例為(B組)對照組。2組病例在性別、年齡分布、治療前各項檢測指標經檢驗差異無統(tǒng)計學意義,均有可比性。所有接受干細胞治療患者均簽署知情同意書。

1.2 手術方法 2組患者入院后均行內科對癥治療。A組在此基礎上給予粒細胞集落刺激因子 400μg,皮下注射,連續(xù) 4 d,第 5天行外周血干細胞采集,單個核細胞計數 1.2×108/ ml～3.1×1010/m l,在DSA下經股動脈穿刺插管,置管于肝固有動脈進行造影,觀察肝內血管情況及有無占位性病變,將干細胞細胞懸液經肝固有動脈緩慢注入,術畢拔管,穿刺點加壓包扎后返回病房,穿刺側下肢制動 8 h,常規(guī)使用抗感染及對癥治療3 d。

1.3 觀察指標 分別于治療后第 8周、24周觀察患者肝纖維化指標[透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)]及肝臟影像學檢查。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件分析結果,數據以ˉx± s表示,組間比較定量資料根據方差齊性采用t或t′檢驗,治療前后比較采用配對t檢驗,分類資料采用χ2檢驗,P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組治療前后肝纖維化指標變化情況 見表 1～表 3。

2.2 肝臟B超檢查 治療前肝臟縮小,肝表現(xiàn)凹凸不平,呈結節(jié)狀,彌漫性回聲增強,分布不均勻。肝內血管粗細不均勻,血管扭曲、閉塞而看不到,尤以肝靜脈明顯,其主干變細,分支狹窄。門靜脈由于血流受阻主干、右支及左支矢狀部增粗,門靜脈主干內徑＞10mm,脾靜脈內徑大于 8mm。治療后24周可見肝臟增大,實質回聲致密,回聲增強增粗。

3 討論

肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)是肝星狀細胞的活化,活化的肝星狀細胞分泌組織金屬蛋白酶抑制劑增加,導致細胞外基質降解減少,使細胞外基質在肝內沉積。肝纖維化及肝硬化是多種慢性肝病的終末期病理表現(xiàn),目前傳統(tǒng)的治療手段難以從根本上修復肝臟的不可逆變化,肝移植是治療各種終末期肝病的最有效方法。然而,由于供體來源不足、操作復雜、移植后免疫排斥和治療費用昂貴等問題,限制了臨床肝移植的發(fā)展。相比之下,細胞移植則具有來源廣泛、創(chuàng)傷性小及可重復進行等優(yōu)點,其中骨髓干細胞近年來被認為是最具治療潛力的供體細胞。薛永杰等[3]對 152例經肝穿刺確診為慢性乙型肝炎及肝硬化患者,應用放射免疫法檢測血清透明質酸、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原水平,結果發(fā)現(xiàn)肝臟病理炎癥及纖維化分級與血清纖維化指標的水平有顯著相關性,組間對比部分有統(tǒng)計學意義,炎癥分級組較為明顯。因此檢測血清纖維化指標的水平對于判斷肝臟炎癥及纖維化程度有一定價值和意義。

表1 2組治療前肝纖維化指標變化情況(±s)

表1 2組治療前肝纖維化指標變化情況(±s)

組別 HA(μg/m l) LN(μg/L) PCⅢ(μg/L)Ⅳ-C(ng/m l) A組 708.2±124.7 181.8±72.6 203.4±71.3 150.2±68.4 B組 722.1±114.2 193.3±98.4 224.9±104.8 148.8±78.3

表2 2組治療8周肝纖維化指標變化情況(±s)

表2 2組治療8周肝纖維化指標變化情況(±s)

組別 HA(μg/m l) LN(μg/L) PCⅢ(μg/L)Ⅳ-C(ng/m l) A組 512.5±115.7 143.8±86.5 176.4±98.4 112.1±62.6 B組 711±125.7 184.2±84.7 211.4±114.7 141.3±74.7

表3 2組治療24周肝纖維化指標變化情況(±s)

表3 2組治療24周肝纖維化指標變化情況(±s)

注：治療前A組與B組比較,P＞0.05;A組治療前與治療后 8周比較,P＜0.05,與治療后24周比較,P＜0.01,A組治療后8周與治療后24周比較,P＜0.01;B組治療前后比較,P＞0.05。

組別 HA(μg/m l) LN(μg/L) PCⅢ(μg/L)Ⅳ-C(ng/m l) A組 245.2±84.7 103.9±74.2 118.0±75.3 74.1±35.3 B組 708.3±123.5 195.5±90.7 222.7±95.4 158.3±66.2

干細胞是具有自我更新、高度增值和多向分化潛能的細胞群體,主要包括造血干細胞和間充質干細胞[4-5]。雖然數量非常少,但卻有強大的自我更新能力,并可以定向或橫向分化為多種組織細胞或組織前體細胞,如造血細胞、肝細胞、神經干細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、胰腺內分泌細胞、皮膚干細胞、Ⅱ型肺泡細胞、腎小管上皮細胞等。也正是因為干細胞具備了該種特性才使其向肝細胞分化成為可能。干細胞治療肝病的巨大應用潛力有 3種細胞可能參與成體肝臟細胞的更新與修復,前 2種為處于分化終點的成熟肝細胞和肝前體細胞,但研究表明移植這兩種細胞存在來源缺乏、治療效果欠佳、免疫排斥等問題,這就需要第三類細胞,即來源于骨髓的多能干細胞。它的特點有：向肝細胞分化的多能性和專能性,強大的增殖能力,取材容易、損傷小、易于自體移植、無移植排斥反應,臨床應用前景非常突出。

肝硬化的預后取決于患者的營養(yǎng)狀況、有無腹水、血清膽紅素和白蛋白水平以及凝血酶原時間,還與病因、年齡和性別有關。一般說來,病毒性肝炎引起的肝硬化預后較差,年齡大者,男性預后較差,如再出現(xiàn)肝腎綜合征、肝性腦病、并發(fā)食管靜脈大出血、嚴重感染等則病情危重,預后極差。內科保守治療主要有：調整飲食與營養(yǎng),還應補充足夠的微量元素,保護肝功能,促進肝細胞修復,補充蛋白質,體育鍛煉,禁戒煙、酒,慎用各類保肝藥,嚴禁使用能夠損害肝臟的藥物,但總體療效欠佳[6-7]。肝硬化往往因并發(fā)癥而死亡,如何改善患者的預后,提高生存率,尚需探討新的治療措施。

近年來,關于干細胞在肝纖維化治療中的研究越來越多。相關資料顯示,干細胞除了有可以分化為肝細胞的潛能外,還可以通過表達高水平的MMPs,尤其是MMP-9來減少肝臟細胞外基質的沉積[8]。外周血干細胞進入肝內分化為肝細胞肝細胞板的修復可以減少肝內炎癥反應,肝內的炎癥因子減少,對肝星形細胞的激活減弱,對肝內纖維組織形成具有抑制作用。外周血干細胞可能通過細胞間信號傳導來促進肝星形細胞凋亡及促進肝內纖維組織降解酶類的產生,使肝內纖維組織形成和降解的平衡趨于纖維組織降解的方向,促進肝纖維化的恢復。

骨髓干細胞在臨床應用領域廣泛,已取得一定療效[9-10]。近年來國內外關于干細胞治療肝病的應用越來越多,Kumar等[11]報告了原發(fā)淀粉樣變性合并進行性肝衰竭,成功進行干細胞移植,術后隨訪 28個月,未出現(xiàn)疾病復發(fā)的臨床征象。姚鵬等[12]行肝動脈介入分別將分離的自體骨髓干細胞移植入肝衰竭患者的肝臟,結果患者癥狀明顯改善,轉氨酶、膽紅素和血氨水平明顯下降,而白蛋白和凝血酶原活動度逐漸上升,未見嚴重并發(fā)癥。許多報道得出類似的結果[13]。可見經肝動脈途徑移植自體干細胞治療晚期肝病療效確切且副作用小,安全,能夠促進患者肝功能改善。

我院采用外周血干細胞治療肝硬化,在全密閉環(huán)境下采集,用一次性耗材,與骨髓采集相比減少污染的機會,且無痛,干細胞數量能達到治療的要求,單個核細胞計數 1.2×108/ml～3.1×1010/ml。在DSA下經股動脈穿刺插管,盡量置管于肝固有動脈,觀察肝內血管情況及有無占位性病變,將干細胞細胞懸液緩慢注入。治療后患者的自覺癥狀改善較明顯,觀察全部 35例患者,第 8周肝纖維化指標較治療前好轉,但改善不明顯,第24周肝纖維化指標明顯改善。肝臟B超檢查發(fā)現(xiàn)治療后 24周可見肝臟增大,實質回聲致密,回聲增強增粗。未發(fā)生嚴重并發(fā)癥,近期無不良反應出現(xiàn)。且發(fā)現(xiàn)干細胞治療對肝纖維化的改善方面Child-Pugh B級患者改善明顯,A級稍差,C級較差。由此可見該療法優(yōu)先用于 B級患者。外周血干細胞治療肝病的優(yōu)點：避免肝臟移植和肝細胞移植的排斥反應。避免長期服用免疫抑制劑帶來的負反應,早期利用骨髓修復肝損傷、改善遺傳性缺陷組織的功能以及代替退行性組織,可極大地延長生存期,回避了對胚胎干細胞應用的倫理爭議,細胞來源獲取方便且治療費用低廉?？梢姽撬韪杉毎浦仓委煾嗡ソ?可在一定程度上恢復肝功能,縮短治療時間,改善預后。探索與驗證干細胞移植治療晚期肝病的新方法和新思路,為解決干細胞移植時細胞來源、患者的選擇及合理移植途徑等關鍵問題是有必要的。

目前,肝纖維化治療仍是一大難題,骨髓干細胞移植為眾多肝纖維化甚至肝硬化患者帶來了曙光,被認為是最具應用前景的措施之一,但其作用機制尚不完全清楚,需要深入研究和探討。盡管在實驗研究中取得了可喜成果,但關于干細胞的臨床研究還相對比較缺乏,因此,還需要更全面更完善的臨床研究設計方案的出現(xiàn)。

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