(蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系,安徽 蚌埠 233030)

馬蹄蟹(Horseshoe crab)是一類遠(yuǎn)古的海洋節(jié)肢動(dòng)物。馬蹄蟹血細(xì)胞中分離提取的一類抗菌肽[1],具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的生物活性[2]?？咕膖achyplesinⅠ因相對(duì)分子質(zhì)量小不具備抗原性,對(duì)原核生物細(xì)胞有很高的殺菌活性,對(duì)真核生物的正常細(xì)胞則無(wú)明顯毒副作用?？咕鷷r(shí)一般沒(méi)有特殊受體,不會(huì)誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生,是一類具有巨大潛在應(yīng)用價(jià)值的抗菌肽。但由于馬蹄蟹是一種珍貴的海洋生物,物種稀少,是瀕臨滅絕生物,且 tachyplesinⅠ的分離純化過(guò)程繁瑣且費(fèi)用較高;通過(guò)化學(xué)合成制備,價(jià)格昂貴,生物活性低;因此采用基因工程制備tachyplesinⅠ成為一種可行的方案[3]。

目前,利用基因重組技術(shù)在體外大量制備活性多肽是生物制品研究的熱點(diǎn)之一。對(duì)于分子質(zhì)量較小的多肽,如果用常規(guī)方法構(gòu)建單拷貝基因的重組質(zhì)粒,則目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)量很低,無(wú)法體現(xiàn)基因工程產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì)。因此,本文建立了一種構(gòu)建串聯(lián)基因的方法,以實(shí)現(xiàn)小分子多肽在體外的高效表達(dá),為小肽的串聯(lián)表達(dá)提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。本研究為了克服基因工程制備 tachyplesinⅠ的缺陷,設(shè)計(jì)構(gòu)建 tachyplesinⅠ基因串聯(lián)表達(dá)載體,并將重組基因成功轉(zhuǎn)化到分泌型表達(dá)系統(tǒng)枯草桿菌 BS168中,實(shí)現(xiàn)了抗菌肽tachyplesinⅠ的高效分泌表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

克隆宿主菌Escherichia coli.DH5α、大腸桿菌E.coliK88、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)為本室保存;枯草桿菌Bacillus subtilisBS168為表達(dá)宿主菌,由上海生命科學(xué)院植物生理與生態(tài)研究所惠贈(zèng);TA克隆載體 pUCM-T購(gòu)自上海生工公司;大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒 pSBPTQ[4]由中山大學(xué)羅進(jìn)賢教授惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

馬蹄蟹購(gòu)自廣東省深圳市水產(chǎn)品市場(chǎng);枯草桿菌感受態(tài)制備用GMI、GMII培養(yǎng)基[5];發(fā)酵用MSR培養(yǎng)基[6]。cDNA合成試劑盒及各種工具酶均購(gòu)自TaKaRa公司;Trizol reagent購(gòu)自 Invitrogen公司;蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、mRNA純化試劑盒購(gòu)自Promega公司;CM Sepharose購(gòu)自Amersham Biosciences;其他生化試劑(分析純)購(gòu)自上海生工;實(shí)驗(yàn)中所用引物(由上海生工合成),各引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 所用引物表Tab.1 PCR primers

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽tachyplesinsⅠ基因的RT-PCR擴(kuò)增

從馬蹄蟹圍心腔采集血液,8 000 r/min 離心10 min 獲得血細(xì)胞[7],用 Trizol處理提取總 RNA,以 mRNA 純化試劑盒獲得 mRNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)一步以cDNA 為模板,參考Genbank收錄的 tachyplesinⅠ基因序列,設(shè)計(jì)了上下游引物Tac-1和Tac-2,見(jiàn)表1。并設(shè)計(jì)了XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。PCR擴(kuò)增獲得的目的基因tac,經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,電泳檢測(cè)后測(cè)序。

1.2.2 串聯(lián)基因(2tac)的設(shè)計(jì)

參照 Genbank上公布的基因序列,設(shè)計(jì)合成兩條完全互補(bǔ)單鏈 tachyplesinsⅠ串聯(lián)基因,5’端設(shè)計(jì)XbaⅠ黏性末端,3’端設(shè)計(jì)KpnⅠ黏性末端。通過(guò)上海生工公司合成帶有上述黏性末端的完全互補(bǔ)的堿基序列,退火合成帶有黏性末端的雙鏈串聯(lián)tachyplesinsⅠ基因。方法合成如下：取等量摩爾濃度25 μmol/L的正反義引物各 4 μL,添加超純水至40 μL。退火條件：80℃水浴退火5 min,然后自然冷卻至30℃,其過(guò)程大概3 h。退火合成串聯(lián)基因(2tac)克隆連接到pUCM-T上進(jìn)行初步鑒定及目的串聯(lián)基因的擴(kuò)增。

1.2.3 串聯(lián)基因2tac的克隆鑒定及體外PCR擴(kuò)增

克隆載體 pUCM-T經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切后,和tachyplesinⅠ基因tac及 2tac經(jīng)T4 DNA 連接酶連接。轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α培養(yǎng),經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選得陽(yáng)性克隆,培養(yǎng)提取質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切初步鑒定,再通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證克隆片斷的正確性。所得克隆質(zhì)粒命名為 pUCM-2TAC和 pUCMTAC。

1.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

以 pUCM-2TAC質(zhì)粒模板,通過(guò)引物 M13經(jīng)PCR擴(kuò)增得到串聯(lián)基因2tac,PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體 pSBPTQ同時(shí)進(jìn)行XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切,T4 DNA連接酶連接,大腸桿菌轉(zhuǎn)化按Sambrook的方法進(jìn)行[8]。轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆,雙酶切鑒定,測(cè)序驗(yàn)證。所得質(zhì)粒命名為 pSBPTQ-2TAC,重組表達(dá)質(zhì)粒 pSBPTQ-TAC和 pSBPTQ-2TAC轉(zhuǎn)化枯草桿菌BS168的方法參照Harwood[9]方法進(jìn)行。

1.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳分析

挑取新鮮轉(zhuǎn)化的枯草桿菌工程菌BS168/pSBPTQ-TAC和 BS168/pSBPTQ-2TAC單菌落接種于含卡那霉素(10 mg/L)的LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)過(guò)夜,作為種子液。然后種子液按5 %接種量轉(zhuǎn)接于含卡那霉素(10 mg/ L)的發(fā)酵培養(yǎng)基(MSR)中,37℃ 250 r/ min 振蕩培養(yǎng)2～4 h,加蔗糖至終濃度2 %誘導(dǎo)表達(dá)[10],每隔 12 h依次取樣,收集的發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心 15 min,取發(fā)酵液上清進(jìn)行Tris-Tricine SDS-PAGE(16.5%)電泳檢測(cè),以確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。用含質(zhì)粒 pSBPTQ的對(duì)照菌體和標(biāo)準(zhǔn)蛋白作對(duì)照。

1.2.6 重組tachyplesinⅠ的分離純化

收集發(fā)酵液12 000 r/min,離心15 min。向發(fā)酵上清液中依次加入硫酸銨使終濃度達(dá)到35%、45%、55%、65%、75%,12 000 r/min離心30 min,收集沉淀,用pH7.4的Tris-HCl緩沖液溶解沉淀。將鹽析濃縮效果最好的溶液裝入透析袋中進(jìn)行透析。透析產(chǎn)物上CM -Sepharose層析柱,用10 mmol/L Tris-HCl(pH6.8)平衡洗脫柱,然后用相同緩沖溶液配制的0～1.0 mol/L的NaCl線性梯度洗脫(2 mL/min),收集活性峰,對(duì)收集樣品經(jīng)冷凍干燥濃縮,用無(wú)菌水配得 tachyplesinsⅠ表達(dá)產(chǎn)物溶液 10 mL。參照謝海偉等[11]高效液相色譜方法檢測(cè) tachyplesinⅠ表達(dá)產(chǎn)物含量。

1.2.7 TachyplesinⅠ串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物2TAC的水解及活性檢測(cè)

取兩份各為 1.0 mL冷凍干燥的串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物2TAC,將其中一份溶于 1.0 mL BrCN溶液(50 g/L,70 %甲酸配制)中,另一份溶于僅含70 %甲酸溶液中,同時(shí)置于 4 ℃冰箱水解處理 24 h,水解后再加1.0 mL的雙蒸 H2O,冷凍干燥以除去甲酸和 BrCN,干制品用無(wú)菌水重新配制成1.0 mL溶液進(jìn)行活性檢測(cè)。上述2TAC水解液產(chǎn)物進(jìn)行活性鑒定,以大腸桿菌 K88和金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌株,分別取5 mg/L的2TAC和TAC,10 mg/L的2TAC和2TAC水解產(chǎn)物,以 BS168/pSBPTQ空質(zhì)粒菌株發(fā)酵液為對(duì)照,參照微量肉湯稀釋法[12]進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。同時(shí)以上述TAC對(duì)供試菌株孵育,參照代建國(guó)等[13]建立方法進(jìn)行透射電鏡觀察,分析細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 TachyplesinⅠ串聯(lián)基因(2tac)的設(shè)計(jì)

TachyplesinⅠ串聯(lián)基因的設(shè)計(jì)如圖1所示,在單 tachyplesinⅠ基因tac的 3’端添加“AAC”密碼子,目的為了使 tachyplesinⅠ基因表達(dá)產(chǎn)物 C末端產(chǎn)生酰氨化結(jié)構(gòu),兩個(gè) tachyplesinⅠ基因通過(guò)蛋氨酸密碼子“ATG”連接,目的在于增添表達(dá)產(chǎn)物的BrCN水解位點(diǎn)。為了便于和表達(dá)載體連接,在串聯(lián)基因的5’端設(shè)計(jì)XbaⅠ酶切位點(diǎn)黏性末端,后加兩個(gè)“AA”為使串聯(lián)基因 2tac在表達(dá)載體的正確閱讀框內(nèi),使其能正確表達(dá),其前加“AA”作為保護(hù)堿基。

圖1 tachyplesinⅠ串聯(lián)基因2tac的設(shè)計(jì)Fig.1 Design of tandem gene of tachyplesinⅠ

2.2 串聯(lián)基因2tac重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將大腸桿菌質(zhì)粒 pSP72的復(fù)制起點(diǎn)及氨芐青霉素抗性基因轉(zhuǎn)移到枯草桿菌質(zhì)粒pUB18上構(gòu)建了大腸桿菌-枯草桿菌穿梭型克隆載體 pSB。然后將枯草桿菌sacB基因的啟動(dòng)子-信號(hào)肽序列(sacB P.S.)及地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)T(amyT)克隆進(jìn) pSB,獲得誘導(dǎo)型表達(dá)-分泌載體 pSBPT,最后將短小芽孢桿菌正調(diào)控基因degQ引入pSBPT,獲得重組質(zhì)粒pSBPTQ,構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2。含2tac基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建如圖3所示,將pSBPTQ用XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切,電泳回收7.5 kb大片段,與經(jīng)XbaⅠ /KpnⅠ酶切的 PCR產(chǎn)物連接,構(gòu)建含2tac基因的重組質(zhì)粒。

圖2 穿梭型誘導(dǎo)表達(dá)載體構(gòu)建 [4]Fig.2 The expression plasmid pSBPTQ

圖3 重組表達(dá)載體pSBPTQ-2TAC的構(gòu)建Fig.3 The recombinant expression plasmid pSBPTQ-2TAC

2.3 TachyplesinⅠ基因(tac)的 RT-PCR 擴(kuò)增以及電泳鑒定

從馬蹄蟹細(xì)胞中提取總 RNA,根據(jù)tachyplesinⅠ基因序列設(shè)計(jì)的引物Tac-1和Tac-2,以馬蹄蟹血細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物,產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析,如圖4所示。在泳道2中出現(xiàn)一條70 bp左右的DNA 條帶。采用退火法合成的串聯(lián)基因2tac,經(jīng)凝膠電泳分析,在泳道1中出現(xiàn)一條120 bp左右DNA條帶。初步證明獲取了目的基因tac和2tac。

圖4 tachyplesinⅠ基因tac和2tac 的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 PCR product of tac gene and 2tac

圖5 重組子pSBPTQ-TAC和pSBPTQ-2TAC的酶切鑒定Fig.5 Restriction enzyme analysis of pSBPTQ-TAC and pSBPTQ-2TAC

2.4 重組表達(dá)載體的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切后凝膠電泳圖見(jiàn)圖5,結(jié)果顯示在約80 bp、150 bp和7.4 kb處有預(yù)期的條帶。初步證明目的基因tac和2tac已經(jīng)克隆到表達(dá)載體上。重組子進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序圖譜如圖6,7所示,測(cè)序結(jié)果采用軟件 CLUSTAL(1.81)進(jìn)行克隆序列和已知tachyplesinⅠ基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果,重組子基因tac和 2tac核苷酸序列和已知tachyplesinⅠ基因序列完全相同,長(zhǎng)度分為 56 bp、119 bp,這表明tachyplesinⅠ基因tac和2tac成功克隆到pSBPTQ載體中,通過(guò)測(cè)序圖譜進(jìn)一步表明,目的基因連接順序和啟動(dòng)子方向一致,在表達(dá)載體的正確閱讀框內(nèi),重組子命名為 pSBPTQ-2TAC和pSBPTQ-TAC。

2.5 重組轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達(dá)及 SDS-PAGE鑒定

與對(duì)照 BS168/pSBPTQ發(fā)酵液相比,在重組子BS168/pSBPTQ-2TAC和BS168/pSBPTQ-TAC的電泳圖中出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶,如圖8中箭頭所指條帶分別大小約為2.0 KD和5.0 KD,表達(dá)產(chǎn)物大小與天然 tachyplesinⅠ多肽和其串聯(lián)體的相對(duì)分子質(zhì)量大小相符,由此可以初步確認(rèn)目的蛋白 2TAC和 TAC在宿主菌種得到了有效地表達(dá),并且分泌到發(fā)酵液中。采用凝膠成像系統(tǒng)分析軟件 GeneTools對(duì)SDS-PAGE電泳的結(jié)果進(jìn)行分析,對(duì)圖8中2,3泳道進(jìn)行掃描,經(jīng)峰面積積分計(jì)算出目的條帶的吸收峰在所有表達(dá)蛋白的吸收峰中所占的百分含量,即為目的蛋白在表達(dá)的全蛋白中的百分含量。本實(shí)驗(yàn)比較的是TAC和2TAC蛋白在全蛋白中的百分含量,經(jīng)GeneTools軟件分析,重組表達(dá)產(chǎn)物TAC和2TAC蛋白表達(dá)量分別約為8.5%、15.8%。

工程菌株B.subtilisBS168/pSBPTQ-2TAC和BS168/pSBPTQ-TAC,經(jīng)蔗糖誘導(dǎo)后,每隔 12 h取樣進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測(cè)。由圖9可以看出,目的蛋白2TAC和TAC隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,表達(dá)量也在增加,當(dāng)誘導(dǎo)24 h時(shí),表達(dá)產(chǎn)量達(dá)到最高值。

2.6 表達(dá)蛋白2TAC和TAC的分離純化及SDS-PAGE鑒定

通過(guò)不同飽和濃度的硫酸銨對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鹽析初步純化,濃縮產(chǎn)物進(jìn)行 MIC 檢測(cè),目的蛋白沉淀量與硫酸銨濃度的關(guān)系見(jiàn)圖10所示,用55%飽和度的硫酸銨處理后,濃縮液抗菌活性最強(qiáng),用55%飽和度的硫酸銨進(jìn)行鹽析可得到最大量的目的蛋白。因此,在分離純化過(guò)程中,先用55%飽和度的硫酸銨沉淀目的蛋白,進(jìn)行濃縮處理。

圖6 重組表達(dá)質(zhì)粒pSBPTQ-2TAC測(cè)序圖譜Fig.6 DNA sequence of pSBPTQ-2TAC

圖7 重組表達(dá)質(zhì)粒pSBPTQ-TAC測(cè)序圖譜Fig.7 DNA sequence of pSBPTQ-TAC

發(fā)酵液經(jīng) 55%飽和度的硫酸銨鹽析沉淀后,在蒸餾水中透析。透析液經(jīng)CM-Sepharose Fast Flow柱層析,結(jié)果圖12(A,B)中顯示出現(xiàn) 4個(gè)蛋白峰,對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行抗菌活性分析后,第Ⅳ峰具有抗菌活性,如圖12(A,B)中箭頭所指。目的產(chǎn)物所在的第Ⅳ峰在低濃度0.1～0.2 mol/L左右的NaCl被洗脫下來(lái),冷凍干燥,用無(wú)菌水配得 tachyplesinⅠ表達(dá)產(chǎn)物溶液10 mL。離子交換柱收集的表達(dá)產(chǎn)物,經(jīng)高效液相色譜分析濃縮的表達(dá)產(chǎn)物TAC和2TAC的濃度分別為5.46 mg/L和10.36 mg/L。純化后經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖11,由電泳結(jié)果可見(jiàn),重組的 2TAC和TAC表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化后,獲得均一的蛋白條帶,分子質(zhì)量大小和上述鑒定相符。表明重組的 2TAC和TAC表達(dá)產(chǎn)物獲得成功。

圖8 表達(dá)產(chǎn)物2TAC和TAC的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

圖9 不同誘導(dǎo)時(shí)間下表達(dá)產(chǎn)物 2TAC和 TAC的 SDSPAGE分析Fig.9 SDS-PAGE of 2TAC and TAC at different induced times

圖10 發(fā)酵液在不同硫酸銨飽和度鹽析下的相對(duì)活性Fig.10 The relative activity of fermentation in different concentrations of (NH4)2SO4

2.7 對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行了活性鑒定,抑菌活性鑒定

通過(guò)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物TAC和2TAC以及2TAC的水解產(chǎn)物的抑菌圈觀察,誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白溶液對(duì)E.coliK88和S.aureus的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)(圖13)。從圖13可以看出,tachyplesinⅠ串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物2TAC的抑菌圈明顯小于單拷貝表達(dá)產(chǎn)物 TAC的抑菌圈,而2TAC經(jīng)BrCN水解后的抑菌圈又明顯大于單拷貝表達(dá)產(chǎn)物 TAC的抑菌圈,這表明 tachyplesinⅠ串聯(lián)體2TAC經(jīng)水解后對(duì)大腸桿菌K88和S.aureus都具有明顯的抑菌活性。

圖11 純化后2TAC和TAC的SDS-PAGE分析Fig.11 SDS-PAGE analysis of purified TAC and 2TAC

同時(shí)表達(dá)產(chǎn)物TAC和供試菌大腸桿菌K88,金黃色葡萄球菌(S.aureus)共同孵育后,從透射電鏡觀察(圖14)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組(圖14-A,C)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞外觀平滑,細(xì)胞壁膜完整,細(xì)胞飽滿,細(xì)胞內(nèi)容物充實(shí)、致密;處理組(圖14-B,D)可以看出幾點(diǎn)變化,部分細(xì)胞膜出現(xiàn)裂解,基本細(xì)胞形態(tài)保持,細(xì)胞外觀粗糙,部分細(xì)胞壁膜裂解,處理后金黃色葡萄球菌有兩處明顯的細(xì)胞膜出孔道現(xiàn)象,細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)松弛,出現(xiàn)少許絨毛;處理后大腸桿菌 K88細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空,部分細(xì)胞器和細(xì)胞核區(qū)消失。上述透射電鏡觀察表明表達(dá)產(chǎn)物TAC具有抗菌活性。

圖12 CM-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換層析圖Fig.12 2TAC and TAC purified by CM-Sepharose

圖13 TAC和2TAC及水解后2TAC對(duì)E.coli K88和S.aureus的抑菌圈

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)前期對(duì) tachyplesinⅠ抗菌譜的研究[10],發(fā)現(xiàn)抗菌肽 tachyplesinⅠ對(duì)枯草桿菌的抑制作用,明顯低于對(duì)大腸桿菌的抑制作用,因此我們嘗試?yán)每莶輻U菌進(jìn)行tachyplesinⅠ的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)首次完成了 tachyplesinⅠ在枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效表達(dá),在此之前進(jìn)行的抗菌肽 tachyplesinⅠ或類似抗菌肽的基因表達(dá)研究中,只有通過(guò)大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)成功的,但表達(dá)產(chǎn)量都很低。如張春義[14]用大腸桿菌表達(dá)成功,對(duì)黃曲霉孢子具有活性;張鈁等[15]成功表達(dá)出抗菌肽 polyphemusinⅡ,并具有抗菌活性。

圖14 產(chǎn)物TAC處理的透射電鏡圖及未處理對(duì)照Fig.14 Transmission electron microscopy of S.aureus and E.coli K88 after treated by TAC

本實(shí)驗(yàn)首次用枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行tachyplesinⅠ串聯(lián)表達(dá),利用大腸桿菌-枯草桿菌穿梭表達(dá)載體pSBPTQ實(shí)現(xiàn)了串聯(lián)基因2tac和單拷貝基因tac在枯草桿菌 BS168中高效的表達(dá)。從表達(dá)產(chǎn)物的生物活性可以看出,串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物 2TAC具有抗菌活性,但其抗菌活性低于單拷貝表達(dá)產(chǎn)物TAC,當(dāng)串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物2TAC用BrCN水解后,水解液的抗菌活性明顯增加,其最小抑菌濃度和單拷貝表達(dá)產(chǎn)物TAC相近。同時(shí)串聯(lián)表達(dá)蛋白在連接處通過(guò)溴化氫水解后,可使表達(dá)產(chǎn)量增倍,這種方法有利于提高 tachyplesinⅠ表達(dá)產(chǎn)量,同時(shí)降低表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒性,實(shí)現(xiàn) tachyplesinⅠ的高效表達(dá)。這一研究結(jié)果為tachyplesinⅠ高效表達(dá)提供了重要研究方法,具有非常重要應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)采用枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)和串聯(lián)基因表達(dá)方式,克服了表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主的抑制作用,大大提高了產(chǎn)量,取得一定成功,但仍有許多地方需要改進(jìn)：(1)本實(shí)驗(yàn)采用的宿主菌 BS168是枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的最為廣泛應(yīng)用宿主菌,有許多優(yōu)點(diǎn),并在本實(shí)驗(yàn)中表達(dá)成功,但宿主菌 BS168仍然存在一定問(wèn)題,在BS168中已發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶、中性蛋白酶 B和三種絲氨酸蛋白酶等多胞外蛋白酶,當(dāng)外源蛋白分泌表達(dá)后,容易被這些蛋白酶降解,從而大大降低產(chǎn)率?？莶輻U菌的這種的特性,可能部分水解抗菌肽,造成表量低,在枯草桿菌 168宿主菌基礎(chǔ)上通過(guò)蛋白酶基敲除等手段,已經(jīng)發(fā)展到多種蛋白酶缺陷型的宿主菌,如 8種蛋白酶的缺陷型WB800是剔除8種蛋白水解酶的工程菌,因此可選擇更理想的表達(dá)系統(tǒng)[16]。另外可以在本文基礎(chǔ)上選擇一些真菌表達(dá)系統(tǒng),如酵母表達(dá)系統(tǒng),霉菌表達(dá)系統(tǒng)或植物表達(dá)系統(tǒng);(2)鑒于本實(shí)驗(yàn) 2拷貝的串聯(lián)基因可以實(shí)現(xiàn)正確的表達(dá),因此可以通過(guò)設(shè)計(jì)新的串聯(lián)基因方法,實(shí)現(xiàn)多拷貝的串聯(lián)基因進(jìn)行表達(dá),以進(jìn)一步降低表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主抑制,同時(shí)水解后成倍提高抗菌肽產(chǎn)量;(3)根據(jù)抗菌肽tachyplesinⅠ氨基酸序列特點(diǎn),尋求更合理且無(wú)毒害的酶切位點(diǎn);設(shè)計(jì)更為合理的,用無(wú)毒的,成本低的酶水解代替BrCN水解。

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