劉 斌,葉德贊,Günter Jost,林 義,黃翔玲,鄭森林

(1.國(guó)家海洋局 第三海洋研究所,福建 廈門 361005; 2.國(guó)家海洋局海洋 生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門 361005; 3.德國(guó)萊布尼茲波羅的海研究所,羅斯托克 D-18119)

弧菌是海洋環(huán)境中常見的條件致病菌,在某些環(huán)境條件下可引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病害。迄今已有分離報(bào)道的水產(chǎn)致病性弧菌達(dá)10多種,危害的對(duì)象包括魚類、甲殼類和貝類動(dòng)物等[1]。劉文華等[2]對(duì)廈門潯江牡蠣養(yǎng)殖區(qū)弧菌的研究表明,水體弧菌密度與牡蠣體的弧菌密度呈密切相關(guān)性,是引起養(yǎng)殖區(qū)牡蠣嚴(yán)重死亡的原因;Vibrio campbellii可引起魚、蝦和貝類的大量死亡[3]; 發(fā)光弧菌V.fischeri可引起大黃魚體表潰爛癥[4]; 而同樣具有發(fā)光特性的V.harveyi感染對(duì)蝦幼體后即在幼體體內(nèi)大量繁殖,致使對(duì)蝦幼體活力下降,游泳能力變差,體色發(fā)白,部分肌肉壞死,是一種在對(duì)蝦育苗和養(yǎng)殖中都經(jīng)常發(fā)生的細(xì)菌性疾病,具有發(fā)病急,傳播廣,感染力強(qiáng),致死率高和防治困難等特點(diǎn),給世界養(yǎng)蝦業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。

作者采用ARDRA、16S rDNA序列測(cè)定、Biolog碳源代謝分析及藥敏試驗(yàn)等方法,對(duì)從福建省晉江市附近水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的貝類軟組織及波羅地海大菱鲆腸道內(nèi)含物中分離得到的 16株發(fā)光細(xì)菌的分類地位進(jìn)行了分析,也為防治海水養(yǎng)殖中潛在的由發(fā)光弧菌引發(fā)的病害提供了幫助。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及主要試劑和儀器

發(fā)光菌培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g,酵母膏1.0g,甘油3 mL,陳海水1000 mL,瓊脂15 g,pH 7.0; 引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,DNA Marker、Ex Taq酶及限制性內(nèi)切酶AfaⅠ、MspⅠ均購自大連Takara公司; Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)由美國(guó)Biolog公司生產(chǎn); 藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 菌株來源

將2008年5月采集自福建省晉江市附近營(yíng)前、白沙及江崎水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的花蛤及牡蠣樣品去除貝殼后研磨,取5 g經(jīng)充分研磨的樣品置于45 mL內(nèi)置玻璃珠的無菌生理鹽水中,振蕩混勻,取上清液稀釋為 10-1,10-2兩個(gè)梯度,各梯度分別吸取 100 μL,用涂布棒均勻涂布于發(fā)光菌培養(yǎng)基上,25℃恒溫培養(yǎng)24 h,于暗室中挑取發(fā)出熒光的菌株。經(jīng)分離純化,共得到12株發(fā)光細(xì)菌。采取同樣的方法于2009年7月在購自市場(chǎng)的波羅地海大菱鲆腸道內(nèi)含物中分離得到4株發(fā)光細(xì)菌。

1.3 細(xì)菌基因組DNA的提取

細(xì)菌基因組DNA的提取參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[7]中的細(xì)菌基因組DNA的小量制備方法,并將提取的DNA模板儲(chǔ)存于－20℃冰箱中。

1.4 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

所用引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物,擴(kuò)增正向引物 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′; 反向引物 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性40 s,56℃退火40 s,72℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán)后,72℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 16S rDNA PCR產(chǎn)物的ARDRA分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶AfaⅠ、MspⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切反應(yīng)體系為 20μL,其中 PCR 產(chǎn)物10 μL,內(nèi)切酶各 0.5 μL,相應(yīng)的 10×Buffer 2 μL,0.1%BSA 2 μL,去離子水 5 μL。37 ℃恒溫 3 h。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 16S rDNA PCR產(chǎn)物測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。用EzTaxon Server version 2.1對(duì)所得到的16S rDNA序列進(jìn)行分析,并用Mega 4.1軟件包采用Neighbor-Joining算法自展 1000次進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.7 Biolog碳源代謝分析

按照 Biolog微生物鑒定操作步驟,調(diào)整接種菌懸液濁度為28%T,接種至96孔GN2微孔鑒定板中,于25 ℃培養(yǎng)至第24小時(shí) 、48小時(shí) 、72 小時(shí),結(jié)合“人工”及“自動(dòng)”兩種讀板模式,分別測(cè)定3次。采用 NTSYS-pc 2.10e軟件對(duì)讀取結(jié)果進(jìn)行聚類分析。

1.8 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用 K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行,于25℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出,記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑(包括藥敏紙片直徑7 mm)。按CLSI抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(2009年版)判斷藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)光細(xì)菌的分離、形態(tài)觀察及染色

經(jīng)分離純化得到16株發(fā)光細(xì)菌(表1),經(jīng)革蘭氏染色及KOH拉絲法驗(yàn)證,這些菌株均為革蘭氏陰性菌; 在發(fā)光菌甘油培養(yǎng)基上的菌落均為圓形,淺黃色,表面光滑濕潤(rùn),邊緣整齊或呈鋸齒狀,隆起形狀分扁平和微凸; 油鏡下觀察,呈長(zhǎng)桿狀、短桿狀或弧狀; 在黑暗中均發(fā)射淺綠色熒光。

2.2 ARDRA結(jié)果分析

研究表明[8],每一個(gè)菌種的16S rDNA都有一個(gè)獨(dú)特的酶切圖譜,每種代表一個(gè)操作分類單位(即OTU),用16S rDNA序列的ARDRA分析可以區(qū)分出菌種。本研究選用限制性內(nèi)切酶AfaⅠ和MspⅠ對(duì)16株發(fā)光菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切分析,其結(jié)果見圖 1。根據(jù)圖 1中的限制性酶切圖譜,可將 16株菌分為 3組,即 3個(gè)不同的 OTUs,其中OTU2包含菌株FY-6和FJ-2,屬于OTU3的僅有菌株FJ-1,其余13個(gè)菌株則均屬于OTU1。

表1 16株發(fā)光細(xì)菌來源Tab.1 The sample sources of 16 luminous bacteria

2.3 16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)發(fā)光細(xì)菌菌落和細(xì)胞形態(tài)、16S rDNA序列的ARDRA指紋圖譜及樣品來源的不同,選取其中5個(gè)菌株進(jìn)行 16S rDNA序列測(cè)定并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。所有測(cè)序菌株均與數(shù)據(jù)庫中已知標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列具有較高的相似性(表 2)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)菌株16S rDNA序列的最高相似性及在系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 2)中所處的分支可知,所有5株發(fā)光菌株均屬于Vibrio屬,分別與V.campbellii,V.orientalis,V.fischeri及V.azureus具有最近的親緣關(guān)系,其中菌株 FY-1和FB-1雖同屬OTU1,鑒定結(jié)果卻有所不同,但兩株菌在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置較為接近。

圖1 限制性內(nèi)切酶AfaⅠ和MspⅠ雙酶切16S rDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of AfaⅠ+ MspⅠdigestion of PCR-amplified 16S rDNAs

2.4 Biolog碳源代謝分析

微生物對(duì)碳源的利用能力是表征微生物生長(zhǎng)情況的主要指標(biāo)[9]。本研究中 5株海洋發(fā)光弧菌的Biolog碳源代謝分析結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性較低,無法鑒定至種。5株菌對(duì) 95種碳源的利用率及聚類分析結(jié)果見圖3,各株菌的碳源利用圖譜均有所不同,其中FY-1可利用57種碳源,FB-1可利用54種,FJ-1則可利用34種,而FJ-2與FY-6的碳源利用譜較窄,分別可利用18種和14種碳源,但各株菌均可利用吐溫 40、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、D-果糖、α-D-葡萄糖、L-天冬酰胺酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天門冬氨酸、肌苷和尿苷等10種碳源。由圖3中的碳源代謝聚類分析結(jié)果可知,菌株FY-6與FJ-2碳源利用情況雖有所差異,但處于同一分支,相似度較高,而其他菌株的碳源利用情況差異較大。

2.5 藥敏試驗(yàn)

選用復(fù)方新諾明、氟哌酸等11種藥物進(jìn)行了藥敏性試驗(yàn)。依據(jù)2009年版CLSI抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果(表 3)。試驗(yàn)結(jié)果表明,各株菌對(duì)同一藥物的敏感性多有不同,但系統(tǒng)發(fā)育分析中親緣關(guān)系較近的FY-6及FJ-2也具有較為相似的藥物敏感性,且所有菌株均對(duì)復(fù)方新諾名和慶大霉素等敏感。

3 討論

近些年來,分子生物學(xué)手段發(fā)展迅速,一些新的基于細(xì)菌基因組序列的分子生物學(xué)方法,如ARDRA、rep-PCR、RAPD等,為細(xì)菌的分離鑒定和多樣性研究提供了有力的工具。ARDRA方法可在16S rDNA序列水平上區(qū)分細(xì)菌種的差異。但研究中也發(fā)現(xiàn)ARDRA存在著一定的局限性：用ARDRA區(qū)分不同的 16S rDNA片段的精確性有賴于所選用的限制性內(nèi)切酶的種類和數(shù)量,選用不同的酶可能會(huì)劃分出不同的OTUs,尤其是要區(qū)分同一個(gè)屬內(nèi)的不同種時(shí)需要用幾種不同的酶消化,以綜合分析得到的電泳圖譜[10]。本研究中,通過AfaⅠ和MspⅠ兩種酶的ARDRA方法篩選菌株,16株發(fā)光細(xì)菌可分為3個(gè)OTUs,但隨后的序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,兩種酶的 ARDRA方法可在屬水平上對(duì)細(xì)菌做有效甄別,也可以區(qū)分同一屬內(nèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種,但難以區(qū)分同一屬內(nèi)的近緣種。

表2 5株發(fā)光細(xì)菌的16S rDNA序列相似性Tab.2 Similarity of 16S rDNA sequences from the five luminous bacteria

圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of the five luminous bacteria and relating species

圖3 發(fā)光弧菌對(duì) 95種有機(jī)碳源的利用率及聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis of the utilizing rates of 95 C-Sources by the 5 strains

16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析表明,選取的5株發(fā)光菌均屬于Vibrio屬,其中菌株FJ-1的近緣種為發(fā)光細(xì)菌V.fischeri; 來源不同的菌株FY-6及FJ-2與具有發(fā)光特性的V.orientalis以100%的置信度處于同一分支,親緣關(guān)系最近;V.azureus為最近報(bào)道的一發(fā)光新種[11],作者自波羅地海分離得到的發(fā)光菌株FB-1與其具有最大的16S rDNA序列相似性達(dá)98.613%; 而發(fā)光菌株FY-1與V.campbellii序列相似性最高(99.926%),但未見有關(guān)于V.campbellii發(fā)光的正式報(bào)道。謝文陽等[12]從臺(tái)灣沿岸淺水區(qū)域分離出來 4株表型特性非常相似的發(fā)光菌株,鑒定為V.harveyi類似種,但也大多與V.campbellii而非V.harveyi,具有最高的16S rDNA序列相似性。

表3 11種藥物對(duì)5株發(fā)光弧菌的抑菌圈直徑及判斷結(jié)果Tab.3 Sensitivity of the five luminous bacteria to 11 drugs

Biolog系統(tǒng)是一種測(cè)定微生物對(duì)95種不同單一碳源利用能力的快速、簡(jiǎn)便方法,適用于陸地環(huán)境、臨床細(xì)菌鑒定[13]。本研究中利用Biolog系統(tǒng)得到的5株海洋發(fā)光弧菌的碳源利用圖譜均有所不同,但無法鑒定至種,主要是因?yàn)楹Ｑ蠹?xì)菌的生長(zhǎng)條件和陸地細(xì)菌有較大區(qū)別,該系統(tǒng)的某些實(shí)驗(yàn)條件不適合海洋細(xì)菌,并且目前該鑒定系統(tǒng)收集的標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫尚無足夠的海洋細(xì)菌的特征資料,可鑒定的種類有限[14]。藥敏試驗(yàn)也屬于菌種鑒定的生化指標(biāo)范圍,其結(jié)果可為海水養(yǎng)殖中潛在的由發(fā)光弧菌引起的病害的防治提供幫助。兩種方法得到的菌株 FY-6和 FJ-2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為相似,與 ARDRA及 16S rDNA序列測(cè)定方法一樣,可將其劃分至同一群體,推測(cè)為V.orientalis的不同亞種。

一般來說,基于16S rDNA序列的分析可將細(xì)菌鑒定到屬的水平,常規(guī)生理生化特征研究方法依然是將細(xì)菌鑒定到種的最精確的方法。結(jié)合ARDRA、16S rDNA序列測(cè)定、Biolog碳源代謝分析及藥敏試驗(yàn)等方法,雖無法鑒定海洋細(xì)菌至種,但可將細(xì)菌區(qū)分為屬內(nèi)分類地位相一致的不同群體,為后續(xù)更精確的在生理生化方面鑒定細(xì)菌提供參考依據(jù)。

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