劉 苗 張勉之 譚小月 袁沙沙

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的嚴(yán)重微血管病變并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的主要病因[1]。DN主要病理特征為腎小球肥大，腎小球和腎小管基底膜（glomerular basement membrane，GBM）增厚，細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性積聚，腎小球、小管間質(zhì)的纖維化。對(duì)其治療目前主要應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑及降血糖藥以延緩其進(jìn)展，尚缺乏針對(duì)性抑制或逆轉(zhuǎn)纖維化的特異性治療措施[2]。五味子可以抗炎、抗氧化、清除氧自由基、增加周圍組織對(duì)葡萄糖的攝取，川芎、牡蠣均有抗氧化、清除氧自由基的作用，且三者有效成分大部分為脂溶性。本研究以五味子為主藥，輔以川芎、牡蠣合成復(fù)方五味子醇提液（SRC），通過(guò)構(gòu)建以鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠DN模型，旨在探討SRC對(duì)DN的治療作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性清潔級(jí)C57BL/6小鼠24只，6～7周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[3]。隨機(jī)分為正常對(duì)照組（對(duì)照組，6只）、DN模型組（模型組，9只）和SRC治療組（治療組，9只）共3組。

1.2 試劑與藥物制備 STZ為美國(guó)Sigma公司出品，用0.1 mol/L pH值為4.5的滅菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉溶液配置成質(zhì)量濃度為12.5 g/L的溶液；SRC由五味子、川芎、牡蠣組成，與90%乙醇加熱回流3 h，提取2次，合并提取液，靜置過(guò)濾,減壓回收乙醇濃縮成浸膏，-20℃保存[4]；所用抗體均由美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建 小鼠自由供給水和食物，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,禁食15 h。模型組與治療組予STZ溶液125 mg/kg腹腔注射，對(duì)照組予等體積枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液；24 h后等量重復(fù)注射；1周后測(cè)晨起血糖，若≥16.7 mmol/L，且2周后尿白蛋白排泄率（UAER）增加，則納入實(shí)驗(yàn)。治療組每只用SRC 0.3 mL/d[相當(dāng)五味子生藥量5 g/（kg·d）]灌胃，模型組、對(duì)照組予等體積自來(lái)水灌胃。每天16:00給藥1次，連續(xù)給藥7周。因血糖未達(dá)標(biāo)或死亡原因剔除部分小鼠，至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，模型組剩余小鼠5只，治療組剩余6只。

1.4 標(biāo)本收集與處理 試驗(yàn)結(jié)束前采用電子天平稱體質(zhì)量，經(jīng)剪尾取血后采用氧化酶法用血糖儀測(cè)定血糖（BS）；代謝籠收集18 h尿，高效液相色譜法[5]測(cè)定尿白蛋白濃度并計(jì)算UAER=尿量（mL）×尿白蛋白濃度（mg/L）/18；采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，摘取左腎，切取部分于中性福爾馬林中固定24 h后脫水、包埋、切片（3 μm），余部分左腎立即置于液氮中，后置于-80℃冰箱保存供Western blotting檢測(cè)用；摘取右腎于電子天平稱其質(zhì)量。

1.5 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 3 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，行Masson、天狼星紅（Sirius Red）染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

1.6 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、纖黏蛋白（FN）表達(dá) 采用免疫組化法檢測(cè)。用3 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用新鮮配制的3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；微波抗原修復(fù)20 min，牛血清白蛋白室溫封閉1 h，依次加一抗（小鼠α-SMA、FN多克隆抗體，濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜)，生物素標(biāo)記二抗工作液及辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，室溫下AEC顯色，蘇木素輕度復(fù)染，自來(lái)水沖洗，脫水、透明、封片。光鏡下觀察α-SMA、FN的表達(dá)。

1.7 E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-SMA、纖溶酶原活化抑制因子-1（PAI-1）蛋白的表達(dá) 采用Western blotting檢測(cè)。取-80℃保存的各組腎組織，勻漿、離心后，蛋白定量、配樣，100℃、8 min變形后上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉，TBST沖洗后加小鼠E-cadherin、α-SMA、羊PAI-1及β-actin的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST液沖洗，加標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育，洗膜后ECL顯色。以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)E-cadherin、α-SMA、PAI-1蛋白的表達(dá)。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組與治療組較對(duì)照組BS明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），治療組與模型組BS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組與治療組體質(zhì)量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），治療組與模型組體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組右腎質(zhì)量和UAER明顯高于對(duì)照組和治療組，治療組UAER高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組BS、體質(zhì)量、右腎質(zhì)量和UAER比較（±s）

表1 各組BS、體質(zhì)量、右腎質(zhì)量和UAER比較（±s）

＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組（1）模型組（2）治療組（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）n656 BS（mmol/L）6.07±0.40 26.55±3.65 26.08±6.68 20.548＊＊＜0.001 0.001 0.889體質(zhì)量（g）26.97±0.84 17.56±1.27 19.35±2.70 23.446＊＊0.001 0.002 0.266右腎質(zhì)量（g）0.132±0.008 0.165±0.018 0.145±0.012 11.642＊＊0.002 0.125 0.024 UAER（μg/h）11.724±0.534 69.459±3.695 29.423±1.884 450.307＊＊＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 腎組織形態(tài)學(xué)變化 Masson染色可見(jiàn)模型組部分腎小管管腔擴(kuò)張、部分腎小管萎縮（圖1A箭頭所示），間質(zhì)區(qū)纖維性物質(zhì)沉積（藍(lán)色），治療組纖維沉積明顯減少；Sirius Red染色可見(jiàn)模型組間質(zhì)區(qū)大量膠原沉積，治療組較模型組膠原沉積明顯減少，見(jiàn)圖1B。

2.3 Western blotting結(jié)果 模型組PAI-1表達(dá)高于對(duì)照組和治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組與治療組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組E-cad?herin表達(dá)低于對(duì)照組和治療組，治療組低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；模型組α-SMA表達(dá)高于對(duì)照組和治療組，治療組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖2、表2。

2.4 免疫組化結(jié)果 對(duì)照組和治療組均僅見(jiàn)正常血管表達(dá)α-SMA，模型組可見(jiàn)腎小球系膜區(qū)及小管間質(zhì)區(qū)α-SMA表達(dá)明顯增加，見(jiàn)圖3；對(duì)照組可見(jiàn)腎小管基底膜及腎小球FN呈線性表達(dá)，腎間質(zhì)無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，模型組腎小球、腎小管周圍間質(zhì)和腎小球系膜區(qū)FN表達(dá)增加，治療組較模型組FN表達(dá)明顯減少，見(jiàn)圖4。

圖2 3組PAI-1、E-caherin、α-SMA蛋白表達(dá)變化

表2 各組PAI-1、E-cadherin、α-SMA與β-actin蛋白印跡條帶光密度比值比較 （±s）

表2 各組PAI-1、E-cadherin、α-SMA與β-actin蛋白印跡條帶光密度比值比較 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組（1）模型組（2）治療組（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）656 0.014 2±0.003 1 0.271 2±0.078 0 0.018 8±0.002 4 19.672＊0.012 0.928 0.013 0.782 5±0.088 3 0.224 1±0.083 1 0.556 5±0.010 0 32.002＊＊0.004 0.049 0.018 0.047 1±0.061 6 1.222 1±0.141 8 0.551 5±0.200 3 32.560＊＊0.004 0.041 0.019 n PAI-1/β-actin E-cadherin/β-actin α-SMA/β-actin

3 討論

DN是導(dǎo)致ESRD的一大主因，雖然利用現(xiàn)代治療手段可以較好的控制血糖和血壓，但臨床上仍有很多患者相繼出現(xiàn)進(jìn)展性的腎臟損害[6]。因此，探索可以阻止DN進(jìn)展的新的治療措施極為重要。

蛋白尿不僅是糖尿病腎臟病變的反映，而且在其病變的進(jìn)展過(guò)程中也起著重要的作用。Kralik等[7]研究表明，尿蛋白與糖尿病腎小球損傷互為因果，且大量尿蛋白也可導(dǎo)致腎小管損傷。尿蛋白對(duì)腎固有細(xì)胞的直接刺激可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如血管緊張素受體Ⅱ、內(nèi)皮素-1及腫瘤壞死因子-α等，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）堆積。SRC可以顯著降低UAER，從而抑制因其引起的腎臟損害。

ECM是DN的另一標(biāo)志性特征，ECM的過(guò)量堆積引起腎小球、腎小管間質(zhì)的纖維化。肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MF）是ECM的主要來(lái)源，α-SMA是MF的標(biāo)志蛋白，而FN是ECM的主要蛋白之一。腎間質(zhì)纖維化主要病理表現(xiàn)為腎間質(zhì)ECM累積、腎小管萎縮、腎間質(zhì)MF增多等。目前認(rèn)為，腎間質(zhì)MF主要來(lái)源為骨髓干細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和腎間質(zhì)局部成纖維細(xì)胞活化。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腎間質(zhì)纖維化疾病中通過(guò)EMT轉(zhuǎn)化而來(lái)的MF約占腎間質(zhì)新增MF的36%左右[8]。所以，EMT可能是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示模型組上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin低于對(duì)照組，經(jīng)7周治療后，E-cadherin顯著上調(diào)；模型組MF標(biāo)志蛋白α-SMA高于對(duì)照組和治療組。治療組小管間質(zhì)區(qū)α-SMA、FN表達(dá)較模型組明顯減少；Masson及Sirius Red染色可見(jiàn)治療組纖維性沉積明顯少于模型組，表明SRC可通過(guò)阻抑小管上皮細(xì)胞向MF轉(zhuǎn)化而減少間質(zhì)ECM的合成，最終抑制小管間質(zhì)纖維化。

PAI-1可抑制纖溶酶原的活化，降低ECM的降解，促進(jìn)組織ECM的積聚。研究發(fā)現(xiàn)，在腎小球纖維化區(qū)域也可檢測(cè)出PAI-1表達(dá)增高[9]。本研究結(jié)果顯示治療組PAI-1表達(dá)低于模型組，且與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該藥可抑制PAI-1表達(dá)并增加ECM的降解，從而改善DN。

綜上，SRC可減少尿白蛋白排泄率，抑制小管間質(zhì)纖維化，從而顯著改善C57BL/6小鼠的DN，阻抑EMT及抑制PAI-1蛋白表達(dá)是其作用機(jī)制。

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