謝利紅 唐安洲 尹時華 譚頌華

放射治療是頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段。在放射治療中，患者的內(nèi)耳、聽神經(jīng)和部分腦干均包括在照射野內(nèi)[1]。60Co輻射導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾為其常見的并發(fā)癥，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。Caspase 3是近年來發(fā)現(xiàn)的類半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，是細胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，單獨或協(xié)同參與水解與凋亡有關(guān)的蛋白質(zhì)[2]。本文旨在研究Caspase 3在螺旋神經(jīng)節(jié)細胞（SGC）中的表達，對放療后螺旋神經(jīng)節(jié)細胞（SGC）的損傷情況進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 白化豚鼠40只，體質(zhì)量250～350 g，普通級，購自湖南省長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部，雌雄不拘。豚鼠自由飲水進食，室溫23～26℃。全部實驗動物用電耳鏡檢查無中耳感染，耳廓反應(yīng)靈敏。隨機分為5組，每組8只，右耳為放射組，左耳為對照組。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 豚鼠用1%戊巴比妥鈉（3.5 μL/g）麻醉固定后，用GWXJ80型60Co遠距離治療機對豚鼠右耳顳部做一次性60Co照射70 Gy，輻射深度2.0 cm，照射范圍為2 cm×2 cm，源皮距80 cm，自制鉛板遮蓋非照射部位。

1.2.2 石蠟標本制備 實驗動物于放療后1、4、7、14和30 d用1%戊巴比妥鈉（3.5 μL/g）麻醉后處死，經(jīng)腹側(cè)取聽泡，暴露耳蝸并在蝸尖鉆孔，推鐙骨底板脫位，刺破圓窗膜，用4%多聚甲醛固定液灌流固定后，再放入固定液4℃固定24 h以上。用10%EDTA脫鈣10～14 d，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，耳蝸中軸切片。

1.2.3 HE染色 石蠟切片脫蠟和水化，蘇木精染液染色10 min，1%鹽酸乙醇分色，流水沖洗后，自來水藍化10 min，0.5%伊紅染液染色1 min，依次經(jīng)70%、85%、95%和100%乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

1.2.4 免疫組織化學(xué) 石蠟切片脫蠟和水化，pH 6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液煮沸熱修復(fù)抗原10 min，3%H2O2室溫孵育15 min，非免疫血清封閉10 min，加Caspase 3一抗（1∶500）4℃6 h，加二抗，室溫下孵育10～15 min，加三抗室溫下孵育10～15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陰性對照染色切片用PBS代替一抗，其他實驗步驟不變。Cas?pase 3的陽性表達為細胞漿呈棕黃色染色。通過IPP6圖像分析軟件計算其光密度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SGC的HE染色 對照組豚鼠SGC結(jié)構(gòu)正常，見圖1，而放療組的SGC在放療后不同時間點出現(xiàn)SGC的萎縮，表現(xiàn)為細胞漿的減少、細胞核濃縮凝集、缺失或者整個細胞的缺失，見圖2。放療后各不同時間點SGC萎縮率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并且隨著放療后時間的延長，上述變化更明顯，見表1。

2.2 SGC的免疫組化染色 放療組SGC的Caspase 3陽性表達較對照組增強，見圖3～5。放療后不同時間點SGC的Caspase 3 OD值與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 SGC萎縮細胞率及Caspase 3的OD值（n=8，±s）

表1 SGC萎縮細胞率及Caspase 3的OD值（n=8，±s）

t為放療各組與對照組比較；＊＊P＜0.01

組別對照組放療組1 d 4 d 7 d 14 d 30 d F SGC萎縮（%）0 22.68±2.45 26.32±1.28 27.26±1.02 32.76±1.25 49.20±6.07 155.54＊＊t-t-12.78＊＊14.84＊＊15.36＊＊18.46＊＊27.73＊＊Caspase 3（OD值）16.38±3.39 45.83±7.20 44.89±5.22 143.68±9.07 28.55±1.29 42.35±5.07 249.13＊＊7.21＊＊6.98＊＊31.17＊＊2.98＊＊6.36＊＊

3 討論

有學(xué)者通過觀察放療后內(nèi)耳螺旋器（Corti器）和血管紋的損傷發(fā)現(xiàn)，放療后內(nèi)耳細胞的損傷呈劑量相關(guān)性[3]。放療對Corti器，外毛細胞損傷比內(nèi)毛細胞更嚴重。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，一次性使用50 Gy劑量對豚鼠耳蝸進行輻射，明顯地產(chǎn)生了聽覺障礙，光鏡及電鏡觀察中均發(fā)現(xiàn)輻射對于耳蝸基底膜內(nèi)毛細胞的破壞要比外毛細胞更為嚴重，并出現(xiàn)神經(jīng)末梢及突觸的損害，并認為這種聽功能的損害不僅與內(nèi)毛細胞的損害有關(guān)，還與神經(jīng)及突觸的破壞有關(guān)[4]。

Enver等[5]研究發(fā)現(xiàn)給予耳顳部33 Gy的放療總劑量后數(shù)小時即可出現(xiàn)耳蝸細胞的損傷，表現(xiàn)為螺旋神經(jīng)節(jié)細胞萎縮或消失，毛細胞缺失，血管紋的萎縮等表現(xiàn)。本研究中也發(fā)現(xiàn)一次性給予70 Gy的射線照射后，出現(xiàn)明顯的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的損害表現(xiàn)。動物實驗證明，在非放療（如噪聲、藥物等）引起的耳蝸細胞損傷中，活性氧起到重要作用，活性氧通過影響線粒體的滲透壓，促進細胞色素C的釋放，活化P53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，促進細胞凋亡[6]。Caspase 3正常情況下，以無催化活性的酶原形式存在于胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)細胞進入凋亡過程時，則經(jīng)由特異的Asp殘基處的蛋白水解作用而被激活，從而產(chǎn)生了蛋白水解作用，形成的Caspase自我放大級聯(lián)反應(yīng)，進而裂解DNA損傷細胞。Cas?pase 3陽性表達意味著細胞凋亡在進行過程中。在本研究中，放療后1、4、7、14和30 d均可見SGC的細胞漿內(nèi)有Caspase 3蛋白表達，表明Caspase 3的活性增高可能與放療后內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的損傷有關(guān)，可能參與了放射治療誘導(dǎo)耳蝸細胞凋亡損傷的調(diào)控。

[1]Ondrey FG,Greig JR,Herscher L.Radiation dose to otologic struc?tures during head and neck cancer radiation therapy[J].Laryngo?scope,2000,110(2):217-221.

[2]Labbe D,Teranishi MA,Hess A,et al.Activation of caspase-3 is asso?ciated with oxidative stress in the hydropic guinea pig cochlea[J]. Hear Res,2005,202(1-2):21-27.

[3]Kim CS,Shin SO.Ultrastructural changes in the cochlea of the guin?ea pig after fast neutron irradiation[J].Otolaryngol Head Neck Surg, 1994,110(4):419-427.

[4]王家東，丁大連，金西銘，等.一次性大劑量60鈷輻射對豚鼠耳蝸影響的實驗研究[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志,1999,7(3):141-142.

[5]Enver A,Mustafa V,Ozan K,et al.Effects of piracetam supplementa?tion on cochlear damage occuring in guinea pigs exposed to irradia?tion[J].Biol Pharm Bull,2006,29(7):1460-1465.

[6]Low WK,Tan MG,Sun L,et al.Dose-dependant radiation-induced apop?tosis in a cochlear cell-line[J].Apoptosis,2006,11(12):2127-2136.