崔艷華，馬 鶯，曲曉軍，李海梅，何勝華

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，150090哈爾濱，maying@hit.edu.cn; 2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，150010哈爾濱)

近年分子生物學(xué)技術(shù)已成為家畜育種及畜產(chǎn)品應(yīng)用研究的有利工具.分離提取高質(zhì)量的基因組DNA是家畜群體遺傳變異、分子標(biāo)記輔助選擇育種、食品可溯性和基因工程等研究的基礎(chǔ).當(dāng)前通常以動物組織和血液為材料，獲得其基因組DNA［1-6］.收集上述樣品技術(shù)操作上存在困難，而且均會對哺乳動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，影響產(chǎn)乳量［7］.牦牛是在高寒、缺氧等嚴(yán)峻自然條件下，經(jīng)過長期自然選擇和自身適應(yīng)而形成的特殊牛種，主要分布在我國青海、四川、甘肅、新疆、云南等地的高原山區(qū).牧民將牦牛視為神物，采取其組織或血液為實驗材料，阻力很大，因此，尋找更為適宜的材料勢在必行.

本研究采用常規(guī)離心方法從牦牛乳中分離體細(xì)胞，選用高鹽法從體細(xì)胞中分離提取基因組DNA，并利用PCR檢測對其進(jìn)行評價.研究表明，該方法提取的基因組DNA可以用于PCR等后續(xù)研究.

1 試驗

1.1 牦牛乳

牦牛乳取自四川麥洼牦牛.取樣后，牦牛乳中加入疊氮化鈉(NaN3，0.4 g/L)防止蛋白沉淀，存于-20℃.

1.2 試劑

蔗糖、Tris堿、鹽酸、氯化鎂、Triton-X-100、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉鹽、異丙醇、無水乙醇、乙二醇丁醚等均為分析純，購自北京試劑公司.蛋白酶K、Taq酶及PCR相關(guān)試劑購自TAKARA公司.引物由上海生工合成.

1.3 主要儀器

高速冷凍離心機(Biofuge Stratos，Heraeus)、紫外可見分光光度計(TU-1800，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、電泳儀(BioRad)、凝膠成像系統(tǒng)(BioRad)、PCR儀(TAKARA公司).

1.4 引物

根據(jù)牛κ-酪蛋白的第4外顯子區(qū)域設(shè)計引物κ-CN F(5'-AGA AAT AAT ACC ATTCTGCAT-3')和κ-CN R(5'-GTTGAATTCTTTGATGTCTCCTTAGAGT-3')，預(yù)期產(chǎn)物片段大小為550 bp［8］.

1.5 牦牛乳中體細(xì)胞的提取

采用常規(guī)離心法提取牦牛乳中體細(xì)胞.收集50 mL牦牛乳，于4℃ 3 000 r/min離心15 min.離心后，牦牛乳分為3部分，上層為脂肪層，中間為脫脂乳，沉淀為體細(xì)胞.棄去脂肪和脫脂乳，用70%乙醇脫脂棉球心擦拭附在管壁上的乳脂.將沉淀重懸于5 mL PBS緩沖液(pH 7.4)中，在4℃下3 000 r/min離心10 min;去上清，將沉淀重懸于少量PBS緩沖液中備用［9］.

1.6 體細(xì)胞中DNA的提取

參見文獻(xiàn)［10］方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改.

1.6.1 體細(xì)胞的裂解

首先將體細(xì)胞重懸于 49 mL Lysis buffer (0.32 mol/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol/L MgCl2，1%Triton-X-100);4℃下3 000 r/min離心10 min;將沉淀重懸于10 mL Wash buffer(0.075 mol/L NaCl，0.025 mol/L EDTA)中，洗滌2次;離心收集沉淀，將其重懸于3 mLTE溶液中(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2 mmol/L EDTA)，加入100 μL 10%SDS和40 μL蛋白酶K(10 g/L)，混勻，放于65℃水浴中1 h.

1.6.2 蛋白的去除

采用高鹽法或酚/氯仿法去除蛋白.高鹽法即溫浴后，加入500 μL 5 mol/L NaCl，混勻，離心3 000 r/min 10 min去除沉淀蛋白.

酚/氯仿法則是在溫浴后，冷卻至室溫，加入RNase，于37℃下作用20～30 min，去除RNA.加入與溶液等體積酚/氯仿(1∶1)，混勻后，12 000 r/min離心10 min;取上清，加入等體積的氯仿，再次抽提.

1.6.3 核酸沉淀

收集水相，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，-20℃下靜置30 min;也可加入等體積的異丙醇或乙二醇丁醚，混勻，室溫靜置10～30 min. 12 000 r/min離心10 min;棄上清，沉淀于70%乙醇洗2次;沉淀于室溫干燥，重懸于100 μL雙蒸水.

1.7 DNA質(zhì)量檢測

1.7.1 瓊脂糖電泳分析

DNA的完整性用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察.

1.7.2 DNA純度鑒定

取提取的基因組DNA，用雙蒸水稀釋100倍，紫外分光光度計測量其在260和280 nm處的紫外吸光值).每個樣品重復(fù)3次，取平均值.以O(shè)D260/OD280值進(jìn)行純度分析.

1.8 PCR

以提取的牦牛乳基因組DNA為模板，以κ-CN F和κ-CN R為引物擴增κ-酪蛋白的第4外顯子區(qū)域.PCR反應(yīng)程序為95℃4 min預(yù)變性，然后以94℃30 s、53℃30 s、72℃30 s為一個循環(huán)，共進(jìn)行 30個循環(huán)，之后 72℃延伸10 min，4℃保存.PCR反應(yīng)體系為:10×PCR buffer 5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，上下游引物(10 μmol/L)2 μL，Taq酶 2 U，DNA 10～50 ng，用雙蒸水補足體積至50 μL.

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳中提取基因組DNA方法研究

2.1.1 高鹽法和酚/氯仿法的比較

去除蛋白的方法主要有酚/氯仿法和高鹽法，其中酚/氯仿法較為常用.但是酚和氯仿等均為有機溶劑，尤其是氯仿具有刺激的揮發(fā)性氣味，對人體有害.本研究采用SDS和蛋白酶K對體細(xì)胞進(jìn)行破膜處理后獲得細(xì)胞裂解液，將其均分為2份，分別采用高鹽法和酚/氯仿法去除其中的蛋白質(zhì).兩種處理均獲得了基因組DNA，但是酚/氯仿方法因多次抽提，DNA損失較大，僅為高鹽法的30%左右(見圖1(a)).

利用紫外分光光度計測量OD260和OD280值，計算OD260/OD280值發(fā)現(xiàn)，酚/氯仿法和高鹽法提取的DNA的OD260/OD280值均接近1.8，表明蛋白去除較為徹底.將兩種方法獲得的基因組DNA分別作為模板，擴增κ-酪蛋白的Ⅳ外顯子區(qū)域，均可獲得特異性PCR產(chǎn)物(見圖1(b)).

天然狀態(tài)的DNA、RNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)和核糖核蛋白(RNP)形式存在.DNP、RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同. DNP在低濃度鹽溶液中幾乎不溶解，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加;RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，因此，采用高鹽法去除蛋白的同時也去除了RNP，即去除了RNA.高鹽法與酚/氯仿法相比操作簡便快速，且省去了酚/氯仿抽提.

圖1 不同去除蛋白方法對牦牛乳中DNA提取的影響

2.1.2 DNA沉淀試劑及沉淀時間的確定

提取核酸類物質(zhì)DNA和RNA過程中，主要采用醇沉淀核酸，如無水乙醇和異丙醇.無水乙醇是首選的沉淀劑，對鹽類沉淀少，可最大限度地降低鹽濃度對后續(xù)實驗的影響，并且容易揮發(fā)除去.但是需要量較大(通常為樣品體積的2～3倍)，且需要在-20℃下放置較長時間(30～60 min).異丙醇沉淀核酸時，需要量小(通常0.6～1.0倍體積)且速度快，并能夠在室溫條件下進(jìn)行，時間短，因此，適用于濃度低、體積大樣品的沉淀.但缺點是異丙醇難以揮發(fā)除去，需要用70%的乙醇漂洗DNA沉淀數(shù)次.近年來，采用乙二醇丁醚提取核酸時，取得了較好的沉淀效果［11-12］.本研究對無水乙醇、異丙醇和乙二醇丁醚的沉淀效果進(jìn)行了比較，由圖2可以看出，異丙醇和無水乙醇的沉淀效果相近，而乙二醇丁醚效果最差，幾乎無DNA.

圖2 不同沉淀試劑對牦牛乳DNA提取的影響

2.2 牦牛乳不同貯藏條件下對基因組DNA提

取的影響

通常取樣時需要備有專用設(shè)備對樣品現(xiàn)場冷凍，以保證樣品低溫保藏.將同一牦牛乳樣品保存在不同貯藏條件下，研究了貯藏條件對DNA提取質(zhì)量的影響.

由圖3可以看出，在4℃下保存3 d以及在-20℃下1～3 d的樣品，提取的DNA較好;以上述樣品提取的DNA為模板，PCR擴增κ-酪蛋白的Ⅳ外顯子區(qū)域，均獲得了約550 bp的目標(biāo)條帶.在-20℃下保存15～30 d的樣品可提取DNA，但濃度有所降低，可用于PCR檢測.在4℃下保存3 d的樣品提取的DNA含量很低，條帶非常微弱，通過加大DNA模板的體積可以用于PCR擴增.

圖3 不同貯藏條件對牦牛乳中DNA分離提取的影響

在4℃下保存15 d的樣品則幾乎沒有分離得到DNA.在30℃下保存的樣品僅僅有微弱的條帶.PCR擴增未得到目標(biāo)條帶.表明上述條件保存的樣品不適宜于DNA的提取.

同時以保存在-20℃下達(dá)半年的牦牛乳樣品為材料，提取了牦牛乳體細(xì)胞的DNA，發(fā)現(xiàn)可以獲得DNA，并可用于PCR擴增.

3 結(jié)論

1)以牦牛乳為材料，建立以牦牛乳中體細(xì)胞提取牦?；蚪MDNA的方法.并通過不同去除蛋白方法和DNA沉淀方法的比較，對該方法進(jìn)行了優(yōu)化.此方法取材容易，操作簡便，避免了有機試劑抽提，且使用試劑價格低廉，適用于后續(xù)的PCR特異性擴增等操作.

2)通過不同貯藏條件對牦牛乳中DNA提取的影響研究發(fā)現(xiàn)，在4℃下短時間保存或在-20℃下長期保存，均可獲得理想的DNA，應(yīng)盡早處理材料，以期獲得最佳的DNA.

3)本研究所建立的以牦牛乳為材料提取DNA的方法，避免了以牦牛組織或血液為實驗材料的取樣困難，為從分子水平上研究牦牛及牦牛乳提供了更為便捷有效的方法.

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