楊 燕，孫長(zhǎng)貴，陳 堅(jiān)，熊 敏，成 軍

碳青霉烯類抗生素為廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌均具有很強(qiáng)的抗菌活性，屬于繁殖期殺菌劑，對(duì)多種β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定，在臨床上大部分被用于多重耐藥菌株引起的嚴(yán)重感染，尤其用于產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和(或)去阻遏表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶(AmpC)的革蘭陰性桿菌引起的感染的治療［1］。近年來(lái)，碳青酶烯類抗生素耐藥腸桿菌科細(xì)菌所致感染爆發(fā)的報(bào)道呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［2-3］，給抗感染治療帶來(lái)重大挑戰(zhàn)［4］。碳青酶烯類抗生素的耐藥機(jī)制之一是與菌株產(chǎn)生碳青霉烯酶有關(guān)，碳青霉烯酶不僅能水解碳青霉烯類抗生素，對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類抗生素也具有水解作用。產(chǎn)生該類酶的菌株藥敏試驗(yàn)理論上應(yīng)表現(xiàn)對(duì)碳青霉烯藥物耐藥，但事實(shí)上，有部分產(chǎn)酶菌株可表現(xiàn)敏感，此種情況尤其在自動(dòng)化檢測(cè)體系中易被忽視，從而導(dǎo)致治療失敗。為了解臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶情況，我們用改良的Hodge 試驗(yàn)對(duì)碳青霉烯類抗生素敏感折點(diǎn)附近的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行碳青霉烯酶檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 390 株腸桿菌科細(xì)菌為我院2005 年6月至2008 年6 月從臨床送檢標(biāo)本中分離所得。其中大腸埃希菌237 株、克雷伯菌51 株、腸桿菌27株、變形桿菌48 株、枸櫞酸桿菌3 株、沙雷菌24 株;無(wú)重復(fù)分離菌株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 和產(chǎn)TEM-5 型肺炎克雷伯菌。

1.2 試劑 MH 瓊脂為杭州天和微生物試劑公司產(chǎn)品。美羅培南、厄他培南、氨曲南、頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸、阿米卡星、妥布霉素和環(huán)丙沙星紙片為Oxoid 公司產(chǎn)品。GNI 細(xì)菌鑒定卡為生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.3 儀器設(shè)備 Vitek 32 全自動(dòng)微生物鑒定儀為生物梅里埃公司產(chǎn)品，PHW-165Q 型恒溫培養(yǎng)箱為寧波自動(dòng)化儀表研究所產(chǎn)品。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn)及待測(cè)菌株的篩選 使用標(biāo)準(zhǔn)的K-B 紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌對(duì)兩種碳青霉烯類抗生素的耐藥性。按照CLSI(美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì))M100-S19 文件推薦，篩選厄他培南抑菌圈直徑在19 ～21 mm 或美羅培南抑菌圈直徑在16 ～21 mm 的腸桿菌科細(xì)菌，進(jìn)行改良Hodge 試驗(yàn)。

1.5 改良的Hodge 試驗(yàn)(MHT)［5］將10 倍稀釋的0.5 麥?zhǔn)蠞岫却竽c埃希菌ATCC 25922 懸液均勻涂布于MH 瓊脂平板，使平板干燥3 ～10 min，于平板中央貼一片厄他培南或美羅培南紙片。用10 μl接種環(huán)或拭子，挑取血瓊脂平板過(guò)夜生長(zhǎng)的3 ～5 個(gè)待測(cè)菌菌落或質(zhì)量控制菌株懸液，從紙片邊緣到平板邊緣的方向劃直線接種。劃線至少有20 ～25 mm長(zhǎng)。35℃培養(yǎng)16 ～20 h。若待測(cè)菌產(chǎn)生碳青霉烯酶，其接種線與大腸埃希菌ATCC 25922 抑菌環(huán)交界處會(huì)產(chǎn)生朝向抑菌圈內(nèi)增強(qiáng)生長(zhǎng)現(xiàn)象，即MHT 陽(yáng)性;反之則為陰性。見圖1。

圖1 改良Hodge 試驗(yàn)結(jié)果

1.6 ESBLs 檢測(cè) 采用CLSI M100-S19 文件推薦方法［5］。

1.7 質(zhì)量控制 用大腸埃希菌ATCC 25922 進(jìn)行常規(guī)紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制，兩種碳青霉烯類抗生素對(duì)質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)結(jié)果均在CLSI 的允許范圍內(nèi)。改良的Hodge 試驗(yàn)質(zhì)量控制，用MHT 陽(yáng)性菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 和MHT 陰性菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn)篩選結(jié)果 K-B 紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)390 株腸桿菌科細(xì)菌，篩選得到厄他培南抑菌環(huán)直徑在19 ～21 mm 或美羅培南抑菌環(huán)直徑在16 ～21 mm 的腸桿菌科細(xì)菌55 株，其中大腸埃希菌22株，克雷伯菌12 株，腸桿菌10 株，變形桿菌9 株，沙雷菌2 株。

2.2 改良Hodge 試驗(yàn)結(jié)果 55 株待測(cè)菌株，MHT陽(yáng)性12 株，其中大腸埃希菌9 株，陰溝腸桿菌2 株，肺炎克雷伯菌1 株。MHT 陽(yáng)性菌株的碳青霉烯類抗生素抑菌圈直徑結(jié)果見表1。

表1 MHT 陽(yáng)性菌株碳青霉烯類抗生素抑菌圈直徑(mm)

2.3 MHT 陽(yáng)性菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果及產(chǎn)生ESBL 情況 12 株MHT 陽(yáng)性菌株均產(chǎn)ESBL;對(duì)部分抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果見表2。

3 討 論

碳青霉烯酶是具有強(qiáng)大水解能力的β-內(nèi)酰胺酶，能水解青霉素、頭孢菌素、單環(huán)內(nèi)酰胺類及碳青霉烯類抗生素。碳青霉烯酶屬于Ambler 分子分類法的A 類、B 類和D 類β-內(nèi)酰胺酶。A 類和D 類酶的活性部位具有絲氨酸;B 類酶即金屬β-內(nèi)酰胺酶，其活性部位具有鋅離子。A 類酶包括陰溝腸桿菌的IMI 21 和NMC 2A 酶、粘質(zhì)沙雷菌中由染色體介導(dǎo)的NMC 2A、Sme 21、Sme 22、Sme 23、IMI 21 酶，以及肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC 1、GES 22 酶。其中以肺炎克雷伯菌KPC 酶?jìng)鞑プ顝V，多見于腸桿菌科細(xì)菌，最早分離于肺炎克雷伯菌，由質(zhì)粒編碼介導(dǎo)。A 類酶可被克拉維酸和他唑巴坦等β-內(nèi)酰胺抗生素所抑制。D 類酶由OXA型酶組成，多見于鮑曼不動(dòng)桿菌。金屬酶多見于銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和沙雷菌等［2］。

表2 部分抗菌藥物對(duì)MHT 陽(yáng)性菌株的抑菌圈直徑(mm)

本研究根據(jù)CLSI 推薦［5］，選擇厄他培南抑菌環(huán)在19 ～21mm 或美羅培南抑菌環(huán)在16 ～21mm 的腸桿菌科細(xì)菌作為待測(cè)菌，旨在檢出表型試驗(yàn)敏感而非耐藥的產(chǎn)酶菌株，以確保藥敏試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，為臨床正確用藥提供依據(jù)。從本研究MHT 陽(yáng)性結(jié)果來(lái)看，符合厄他培南篩選條件的MHT 陽(yáng)性株占總陽(yáng)性株的83.33%(10/12)，符合美羅培南篩選條件的MHT 陽(yáng)性株占總陽(yáng)性株的25%(3/12)。提示厄他培南篩選的指示效果高于美羅培南，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡可能考慮用厄他培南紙片進(jìn)行篩選試驗(yàn)。

研究結(jié)果表明，我院腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶以大腸埃希菌較為多見，占MHT 陽(yáng)性菌的75%(9/12)，其次為陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯菌。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這類菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的監(jiān)測(cè)。

本次研究中改良Hodge 試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株均產(chǎn)ESBL。由于碳青霉烯類抗生素為治療產(chǎn)ESBL 腸桿菌科細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染的一線藥物［6］，所以臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)ESBL 陽(yáng)性菌進(jìn)行改良Hodge 試驗(yàn)檢測(cè)其是否產(chǎn)碳青霉烯酶很重要。

對(duì)于MHT 陽(yáng)性而對(duì)碳青霉烯類抗生素表型試驗(yàn)敏感的腸桿菌科細(xì)菌，CLSI 建議在報(bào)告結(jié)果前，應(yīng)執(zhí)行MIC 試驗(yàn)，如對(duì)任一種碳青霉烯類藥物敏感(厄他培南MIC≤2 μg/ml、美羅培南MIC≤4 μg/ml或亞胺培南MIC≤4 μg/ml)，只報(bào)告碳青霉烯類藥物的MIC，無(wú)需解釋結(jié)果。報(bào)告中可作如下注釋，“此菌株被證明產(chǎn)碳青霉烯酶。用碳青霉烯類藥物治療藥敏試驗(yàn)對(duì)碳青霉烯類藥物敏感但體外試驗(yàn)證明產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌引起的感染，其臨床療效尚不明確?！?/p>

抗生素是臨床治療感染性疾病的最有力武器［7］，抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥菌株日趨增多、耐藥程度日趨增強(qiáng)，迫使我們需要進(jìn)一步合理使用抗生素。以亞胺培南和美羅培南為代表的碳青霉烯類抗生素為治療重度感染的一線經(jīng)驗(yàn)治療藥物［8］，然而碳青霉烯類抗生素藥敏試驗(yàn)敏感但產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株引起的臨床感染，給臨床治療帶來(lái)較大的困擾。臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立測(cè)試碳青霉烯酶方法，及時(shí)準(zhǔn)確的報(bào)告結(jié)果。

改良的Hodge 試驗(yàn)，可用于檢測(cè)碳青酶烯類抗生素敏感的菌株產(chǎn)碳青酶烯酶的情況，在檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌時(shí)具有90%以上的敏感性和特異性［5］，但此法為一種表型試驗(yàn)，不能將碳青霉烯酶分型。對(duì)于MHT 試驗(yàn)陽(yáng)性菌株的基因分型，還有賴于PCR進(jìn)行基因檢測(cè)。

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