譚周才，劉祝祥，賀 樂，向 芬，陳奇輝，石進(jìn)校

（吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000）

內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）一詞首先是由De Bary在1886年提出，系指生活在植物組織內(nèi)的微生物。Petrini進(jìn)一步將概念擴(kuò)展為：生活史中某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒有引起明顯病害癥狀的微生物[1]。內(nèi)生真菌，不但能產(chǎn)生與宿主相同或相似的化學(xué)成分，而且，還能夠獨(dú)立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物。從內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中分離出來的生物活性物質(zhì)有51%是新物質(zhì)，具有重要研究?jī)r(jià)值[2-7]。蛇足石杉的藥效成分石杉?jí)A甲（Huperzine A）臨床上已用于治療各種原因和不同年齡組的老年人記憶減退和早期老年癡呆癥，療效顯著[8]。石杉?jí)A甲化學(xué)合成有其難以克服的局限性[9]，天然石杉?jí)A甲主要還是從蛇足石杉等植物中提取。由于石杉?jí)A甲在植物中含量非常低，植物生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致石杉科植物的掠奪式采挖，從而破壞了天然資源的可持續(xù)開發(fā)。因此，通過人工栽培或分離蛇足石杉內(nèi)生真菌，尋找能產(chǎn)生石杉?jí)A甲的內(nèi)生真菌顯得尤為重要。盡管內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同化學(xué)成分，但產(chǎn)量低，難以產(chǎn)業(yè)化，通過栽培藥用植物，滿足市場(chǎng)需求仍然是主要手段。沈曉霞等[10]對(duì)蛇足石杉外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)植株中有內(nèi)源真菌的共生，并標(biāo)記了內(nèi)源真菌的共生部位。石瑋等[11]從千層塔的莖中分離出4株內(nèi)生真菌，分別屬于頂孢霉屬、單軸霉屬、酵母和青霉屬。黎萬奎等[12]從蛇足石杉中分離出支頂孢屬內(nèi)生真菌菌株能夠產(chǎn)生石杉?jí)A甲，有望成為石杉?jí)A甲新藥源。徐巧玉等[13]對(duì)湘西產(chǎn)蛇足石杉內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究，從蛇足石杉中共分離出5株內(nèi)生真菌，其中一株經(jīng)過初步鑒定為枝孢霉。本重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在開展湘西產(chǎn)蛇足石杉內(nèi)生微生物多樣性研究時(shí)，得到一株內(nèi)生真菌，現(xiàn)將分離和鑒定結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 蛇足石杉植株采自湖南古丈縣，采樣時(shí)選取健康、生長(zhǎng)較為旺盛的植株，采集時(shí)帶根部土采集，帶回實(shí)驗(yàn)室后，立即對(duì)材料進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑 分子生物學(xué)試劑購(gòu)自上海生物工程公司，ITS 擴(kuò)增和測(cè)序引物（ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；ITS5：GGAAGGTAAAAGTCAAGG）由寶生物工程（大連）公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 將采集的蛇足石杉材料，洗凈后進(jìn)行表面消毒。表面消毒程序?yàn)椋?5%乙醇浸泡40 s，無菌水沖洗3～4次，0.1%升汞浸泡8 min，無菌水沖洗3～4次，0.3%雙氧水浸泡10 min，無菌水沖洗3～4次，置于無菌水中準(zhǔn)備接種。無菌操作把表面消毒后的蛇足石杉植株用刀片切成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，直接接種于分離培養(yǎng)基上，切口與培養(yǎng)基接觸，同時(shí)將最后一次清洗外植體的無菌水按0.1mL/皿涂布于分離培養(yǎng)基上作為對(duì)照。將分離平板和對(duì)照平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)10～15 d。在培養(yǎng)期間觀察對(duì)照平板是否長(zhǎng)菌，并將外植體上長(zhǎng)出的菌體用接種針依次轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行編號(hào)，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)。采用尖端菌絲分離純化的方法，將挑出來的真菌經(jīng)過反復(fù)純化，直到得到純化的典型菌落。

1.2.2 內(nèi)生真菌的基因組DNA提取 平板上挑取米粒大小菌絲置于碾缽中，加少許石英砂與600 μL的CTAB溶液勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，置于60℃恒溫水浴鍋中水浴30min。取出離心管，往離心管中加入600μL抽提液（酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1）輕搖至勻，4℃、14 000 r/min 離心 10 min。取上清液約300μL，轉(zhuǎn)管再次抽提，直至兩層液相間無白色膜狀物質(zhì)。取離心后的上清液300μL轉(zhuǎn)管，每管中加3 mol/L醋酸鈉約30μL，輕搖至勻，補(bǔ)加-20℃無水乙醇600μL，搖勻后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱中冷凍15 min。取出離心管，4℃、14 000 r/min離心10min，棄上清液，留沉淀。向離心管中加入70%乙醇 1mL，4℃、14 000 r/min離心 10 min，倒出上清液，再將離心管中沉淀置于37℃干燥箱中烘干。向烘干后的離心管中加入20μL的TE緩沖液，于4℃保存，待用。

1.2.3 內(nèi)生真菌ITS序列擴(kuò)增和測(cè)序 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer 5.0μL，dNTP 4.0μL（2.5mM/μL）；Primer1 ITS4 1.0 μL （25 pmol/μL），Primer2 ITS5 1.0 μL（25 pmol/μL）；Taq 酶 0.2 μL（3 U/μL），去離子水37.8μL。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度95℃ 1 min；變性溫度95℃ 1min，退火溫度51℃ 1min，延伸溫度72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；35個(gè)循環(huán)后再72℃ 延伸10min，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。按照上述擴(kuò)增條件進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物寄上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析 將測(cè)得ITS-5.8S rRNA FASTA格式的序列用NCBI（National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站提供的BLAST服務(wù)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索高度相似序列，調(diào)取同源性高的相關(guān)序列組成序列集；然后用CLUSTAl X軟件包中的Alignment程序進(jìn)行多重序列比對(duì)，用Trees程序計(jì)算序列間的相似性；用BioEdit軟件進(jìn)行序列剪輯；系統(tǒng)進(jìn)化距離矩陣根據(jù)Kimura模型估算；用MEGA 4.1（Molecular Evolutionary Genetics Analysis software 4.1）軟件包中相關(guān)程序采用鄰接法（Neighbor-Joining）進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌JSM 09的分離純化

經(jīng)表面消毒后的外植體接種至培養(yǎng)基上置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～15 d后，可看到外植體切口邊緣有真菌長(zhǎng)出，對(duì)照培養(yǎng)皿上無菌生長(zhǎng)，證明所分離的微生物為內(nèi)生微生物（如圖1）。根據(jù)菌落形態(tài)、菌落正反面顏色等特征將菌落挑出并編號(hào)，采用尖端菌絲分離純化法，將挑出來的真菌經(jīng)過反復(fù)純化，察氏培養(yǎng)基分離得到16株，PDA培養(yǎng)基分離得到66株，共得到82株純化的典型真菌菌落，其中一株真菌編號(hào)為JSM 09。

圖1 內(nèi)生真菌分離照片

2.2 內(nèi)生真菌JSM 09的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

按照上述方法對(duì)內(nèi)生真菌JSM 09的ITS進(jìn)行測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析，JSM 09的ITS序列如下：

以非褶菌目Antrodiella屬（小薄孔菌屬）的Antrodiella citronella菌株為外群，JSM 09基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，與Antrodiella屬同屬非褶菌目的Irpex屬（耙齒菌屬）菌株都聚類在系統(tǒng)發(fā)育樹一個(gè)大枝上，Irpex屬的3個(gè)不同種菌株在這個(gè)大枝上又形成3個(gè)獨(dú)立穩(wěn)定的小枝，而菌株JSM 09和Irpex屬的3個(gè)Irpex lacteus菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為密切，聚在同一個(gè)小枝上，且與Irpex lacteus XSD-2距離最近，相似程度為99%。因此，從系統(tǒng)發(fā)育分析來看，JSM 09應(yīng)為Irpex lacteus。

圖2 JSM 09基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

以湘西產(chǎn)蛇足石杉為材料，經(jīng)過嚴(yán)格的表面消毒，從蛇足石杉內(nèi)分離純化得到1株內(nèi)生真菌JSM 09。對(duì)JSM 09進(jìn)行基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明：菌株JSM 09和Irpex屬的3個(gè)Irpex lacteus菌株聚在一個(gè)枝上，且與Irpex lacteus XSD-2距離最近，相似程度為99%，JSM 09鑒定為白耙齒菌（Irpex lacteus）。耙齒菌屬（Irpex）由Fries建立，目前在我國(guó)報(bào)道的有3個(gè)種[14]。白耙齒菌菌絲發(fā)酵產(chǎn)物，臨床上用來治療因腎小球腎炎所導(dǎo)致的尿少、腰痛、血壓升高等癥狀，能明顯消除或減少慢性病人的尿蛋白、紅細(xì)胞，因此，該菌株有一定利用價(jià)值[15]。白耙齒菌原本是森林木材的腐生菌，作為內(nèi)生真菌被首次報(bào)道，腐生真菌作為內(nèi)源真菌存在于健康植物當(dāng)中，其生態(tài)功能如何，值得進(jìn)一步研究。

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