楊曉志，李偉星，張君勝，張 力

（江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

蘇氨酸為一種重要的氨基酸，在飼養(yǎng)業(yè)、食品以及醫(yī)藥行業(yè)等方面都有著極其重要的用途[1]。2005年蘇氨酸全球產(chǎn)量達(dá)到7萬t，繼谷氨酸、賴氨酸后成為年產(chǎn)量第三的氨基酸。我國的氨基酸發(fā)酵工業(yè)相對落后，工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)蘇氨酸的水平提高緩慢，每年都需進(jìn)口蘇氨酸類產(chǎn)品以滿足市場需求，短期內(nèi)國內(nèi)市場供需矛盾無法根本解決[2-5]。因此，開展L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的選育與發(fā)酵條件的研究，對提高蘇氨酸的產(chǎn)率、縮短我國氨基酸發(fā)酵工業(yè)與國際水平的差距都具有一定的意義。

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蘇氨酸是目前主要的工業(yè)生產(chǎn)方法，由于大腸桿菌（Escherichia coli）繁殖迅速、發(fā)酵溫度高、生理生化基礎(chǔ)研究比較深入等特征成為L-蘇氨酸生產(chǎn)的最常用菌株[6]。本研究對利用Red同源重組技術(shù)無痕敲除dapA基因獲得的大腸桿菌工程菌K12△dapA進(jìn)行搖瓶分批發(fā)酵優(yōu)化試驗，篩選最佳種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件和最佳發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)條件，旨在為工程菌的發(fā)酵條件控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 大腸桿菌工程菌K12△dapA，由本研究室構(gòu)建，該菌缺失二氫吡啶二羧酸合成酶（dapA）的編碼基因，為產(chǎn)L-蘇氨酸的賴氨酸缺陷型菌株。

1.1.2 試 劑 生物素、硫胺素、L-蛋氨酸為上海生工產(chǎn)品。其他試劑均為國藥分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30、玉米漿20、硫酸銨5、磷酸二氫鉀1、七水硫酸鎂0.5、碳酸鈣 15、pH 7.0，115℃ 滅菌 15min，4℃保存?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖120、玉米漿15、硫酸銨30、磷酸二氫鉀1、七水硫酸鎂0.5、碳酸鈣 15，生物素 100 μg/L、硫胺素 300 μg/L，pH 7.0，115℃ 滅菌15min，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 分析方法 （1）種子生長曲線的測定：取一環(huán)新鮮活化的菌種，接于裝有30mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，振蕩培養(yǎng)，每隔一定時間取樣200μL用5mL 0.25 M HCl溶液稀釋26倍后測定菌液吸光度（OD562）[7]。以時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長曲線。（2）L-蘇氨酸測定：用薄層層析法定性和茚三酮比色法定量測定，具體試驗方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.2.2 種子培養(yǎng)方法 取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，37℃恒溫靜置培養(yǎng)過夜。接一環(huán)生長良好的活化斜面至裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，8層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上200 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法 取種子培養(yǎng)液以10%接種量接入裝有15mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，8層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上200 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)72 h。每個試驗組至少重復(fù)2次。

1.2.4 種子培養(yǎng)基主要成分的優(yōu)化 對種子培養(yǎng)基中幾種主要成分：葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、酵母膏各取3個水平，對它們進(jìn)行4因素3水平的正交試驗。正交實驗因素與水平的選取如表1所示。每個試驗組重復(fù)2次。

表1 正交試驗因素與水平 （g/L）

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[9-12]采用6因素10水平10組試驗的方式[U*10（106）均勻表]，考察了葡萄糖（X1）、硫酸銨（X2）、玉米漿（X3）、KH2PO4（X4）、生物素（X5）、蛋氨酸（X6）對產(chǎn)酸的影響。各因素的水平數(shù)、試驗安排見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子培養(yǎng)基的優(yōu)化及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 種子培養(yǎng)基碳氮源的選擇 為了尋找最適宜菌種生長且利于后期產(chǎn)酸的種子培養(yǎng)基成分，比較了幾種碳氮源對于菌種生長及產(chǎn)酸的影響。所選的碳源有葡萄糖、檸檬酸鈉、蔗糖和麥芽糖，氮源有硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和乙酸銨。碳源添加量以與所添加的葡萄糖達(dá)到相同的含碳質(zhì)量為準(zhǔn)，氮源添注：葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、KH2PO4添加量單位為g/L、蛋氨酸、生物素添加量為μg/L。加量以與所添加的硫酸銨達(dá)到相同的含氮質(zhì)量為準(zhǔn)。將菌種接入不同成分的種子培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵72 h，以產(chǎn)酸為指標(biāo)，其結(jié)果如圖1、2所示。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基均勻設(shè)計試驗方案

圖1 種子培養(yǎng)基不同碳源的比較

圖2 種子培養(yǎng)基不同氮源的比較

從圖1可以看出，葡萄糖是幾種碳源中最利于產(chǎn)酸的。同時還可以看出以單糖作為種子培養(yǎng)基碳源明顯比用二糖產(chǎn)酸要好。由圖2可知，硫酸銨是最佳的種子培養(yǎng)基氮源。葡萄糖和硫酸銨分別是種子培養(yǎng)基最佳碳氮源，這可能是因為以此為培養(yǎng)基的種子能夠更快地適應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基的環(huán)境。

2.1.2 種子培養(yǎng)基主要成分的優(yōu)化 確定了種子培養(yǎng)基的碳氮源之后，對種子培養(yǎng)基中主要成分葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、酵母膏各取3個水平，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗。結(jié)果如表3所示，種子培養(yǎng)基各組份含量的不同對產(chǎn)酸是有影響的。如果培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)過于豐富，會引起菌體生長過快，以致發(fā)酵產(chǎn)酸后勁不足；但如果營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，導(dǎo)致種子生長緩慢，代謝活力低，也不利于高產(chǎn)酸。

由表3可知，各因素對產(chǎn)物的影響順序依次為玉米漿、酵母膏、葡萄糖和硫酸銨。玉米漿對種子質(zhì)量影響最大，酵母膏其次，這是因為玉米漿和酵母膏中含有豐富的生物素、游離氨基酸和多種生長因子，是較理想的營養(yǎng)物質(zhì)，微生物在這種富含有機氮源的培養(yǎng)基中，可以直接利用游離氨基酸或其它有機化合物的碳架，合成用于構(gòu)成細(xì)胞的蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞物質(zhì)，有利菌體生長。因此，確定各因素的最優(yōu)水平為A1、B3、C3、D2。根據(jù)正交試驗結(jié)果和實際考慮確定最佳種子培養(yǎng)基配比（g/L）：葡萄糖30，（NH4）2SO46，玉米漿 40，酵母膏 0.8，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，碳酸鈣 15。

表3 L9（34）正交表試驗表及正交結(jié)果

由表4可看出，當(dāng)置信度為0.05時，玉米漿和酵母膏對種子培養(yǎng)基的影響極顯著。由于正交試驗所確定最佳條件并未包含在正交表的9個試驗中，為了進(jìn)一步確定計算結(jié)果，采用最佳條件進(jìn)行了驗證，結(jié)果見表5。

表4 正交試驗方差分析

表5 驗證試驗結(jié)果

由表5可知，驗證試驗的產(chǎn)酸量處于正交試驗的較高水平，試驗結(jié)果較為理想。

2.1.3 種子培養(yǎng)時間確定 將大腸桿菌工程菌K12△dapA從新鮮斜面活化培養(yǎng)基上取一環(huán)接種到最佳種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔一定時間取出少量種子液，用0.25 M HCl稀釋20倍后測定種子液的OD562值，繪制種子生長曲線，結(jié)果如圖3。

圖3 大腸桿菌工程菌K12△dapA生長曲線

從生長曲線中可以看出，菌體從3 h開始進(jìn)入對數(shù)期，10 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期。一般選對數(shù)生長期后期到穩(wěn)定期前期這段時間內(nèi)的菌種作為種子，因為此時菌體數(shù)量多、生長旺盛。根據(jù)圖3所示結(jié)果，取8 h作為最佳種子培養(yǎng)時間。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

根據(jù)表2發(fā)酵培養(yǎng)基均勻試驗設(shè)計，水平1至10 的實測值 分 別 為 ：5.25、3.57、3.47、4.07、3.04、7.42、7.56、6.78、5.52、4.09 g/L。經(jīng)過回歸分析獲得R2=0.997 219，回歸方程如下：

表6 回歸結(jié)果

由表6各變量影響顯著性檢驗值t可排出各因素對產(chǎn)酸的影響大小順序：X4>X3>X5>X2，根據(jù)MDAS數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的分析可直接找出極值，結(jié)合實際取 X2=55，X3=30，X4=0.2，X5240，X6=200，代入回歸方程，預(yù)測產(chǎn)L-蘇氨酸為8.48 g/L。

優(yōu)化結(jié)果：以上述優(yōu)化種子分別接入原發(fā)酵培養(yǎng)基（1號）和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（2號）進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)酵試驗，結(jié)果如表7所示。結(jié)果表明，由回歸方程所得出的最高產(chǎn)酸量的預(yù)測值與驗證試驗的平均值較接近，說明回歸方程能夠比較真實地反映各因素對L-蘇氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，對于發(fā)酵條件的研究具有較好的指導(dǎo)意義。

表7 發(fā)酵比較結(jié)果

根據(jù)上述結(jié)果，確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配比（g/L）：葡萄糖 120，硫酸銨 55，玉米漿 30，KH2PO40.2，七水硫酸鎂0.5，生物素240μg/L，硫胺素300 μg/L，蛋氨酸200 μg/L ，CaCO330(分消)。

3 討論

L-蘇氨酸是初級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)物的形成與菌體的生長相關(guān)，一方面，生長良好的菌體其生長速率較高，即葡萄糖將有效地導(dǎo)向L-蘇氨酸的合成；另一方面，如果菌體生長過于旺盛，過多的用于合成細(xì)胞碳架結(jié)構(gòu)，相應(yīng)的合成L-蘇氨酸的代謝流就會減少。所以發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是合理利用微生物發(fā)酵能力的保證。而良好的種子培養(yǎng)基配方是保證發(fā)酵種子生長旺盛、發(fā)酵產(chǎn)酸穩(wěn)定高產(chǎn)的先決條件，因此，優(yōu)化種子培養(yǎng)基很有必要。

本研究通過對大腸桿菌工程菌K12△dapA進(jìn)行種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，得到的最佳種子培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖 30，（NH4）2SO46，玉米漿40，酵母膏 0.8，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，碳酸鈣15，pH 7.0，37℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為 200 r/min，裝液量為30mL/250 mL搖瓶，最佳種齡為8 h。在此條件下產(chǎn)酸由3.7 g/L提高至3.8~3.9 g/L。應(yīng)用均勻設(shè)計試驗法，確定了最適發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及配比(g/L)：葡萄糖 120，硫酸銨 55，玉米漿 30，KH2PO40.2，七水硫酸鎂 0.5，生物素 240μg/L，硫胺素 300μg/L，蛋氨酸 200μg/L，CaCO330（分消）。發(fā)酵72 h產(chǎn)酸由3.8~3.9 g/L提高至8.2~8.3 g/L，通過培養(yǎng)基優(yōu)化產(chǎn)酸（3.7 g/L）提高了近1.2倍。

[1] Debabov,Vladimir G.The threonine story[J].Advancesin Biochemical Engineer-Biotechnology，2003,79:113-136.

[2] 賈冬舒.蘇氨酸市場現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].飼料廣角,2006，（1）：28-29.

[3] 王宏齡，富春江，韓小丹，等.全球主要氨基酸生產(chǎn)企業(yè)新動向[J].精細(xì)與專用化學(xué)品，2005，24：29-38.

[4]Cho JY,Kim D C,Lee B C,et al.Method for producing L-threonine:U.S.A,7074602[P],2006：7-11.

[5] 許益清，張偉國.L-組氨酸產(chǎn)生菌株的選育[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（1）：83-85.

[6] 杜連祥，路福平.微生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社，2005.174-184.

[7] 方開泰.均勻設(shè)計與均勻設(shè)計表[M].北京:科學(xué)出版社，1994.

[8]夏 永.均勻設(shè)計在微生物制藥工藝研究中的應(yīng)用-利用計算機進(jìn)行試驗的設(shè)計與分析 [A].第七次全國抗生素學(xué)術(shù)會議，1993.