初國超，鄭先哲，張文浩，丁凝冶，劉成海

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱 150030）

食品加工過程中的微生物含量檢測是保證食品安全，控制食品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)階段，我國的主要儀器檢測是在食品生產(chǎn)完成后，在實驗室內(nèi)進(jìn)行，如出現(xiàn)質(zhì)量問題，則此批產(chǎn)品就無法再利用，檢測結(jié)果嚴(yán)重滯后于生產(chǎn)，一旦出現(xiàn)問題，將會造成極大的浪費。產(chǎn)品生產(chǎn)過程的控制難度較大，同一產(chǎn)品不同批次的品質(zhì)、風(fēng)味差異較大，難以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化[1]。對于發(fā)酵食品來說，發(fā)酵液中常存在對酶干擾的物質(zhì)[2]。并且多數(shù)不是清澈透明的,常規(guī)的光譜方法不適于測定發(fā)酵液中的物質(zhì)，但生物傳感器對這些情況有較好的適應(yīng)性，并且應(yīng)用很廣泛。Rasooly使用SPR生物傳感器快速檢測出了食物中葡萄球菌腸毒素B（SEB）的濃度[3]。Naimushin等運用微型集成式雙通道SPR傳感器能直接檢測低于納摩爾水平的SEB蛋白毒素[4]。Van等利用SPR技術(shù)檢測食品中毒枝菌素的含量[5]。Gertie等利用SPR生物傳感器檢測沙門氏菌B、D、E，此法成功的在1×107cfu·mL-1樣品中檢出沙門氏菌53個[6]。向四海等研究了使用表面等離子體諧振SPR-2000生化分析儀檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B（SEB）與羊單克隆抗體IgG的免疫吸附反應(yīng)[7]。葛晶等根據(jù)大腸桿菌抗體的免疫吸附反應(yīng)，使用SPR生物傳感器快速檢測大腸桿菌E.coli O157∶H7，采用親和素-生物素系統(tǒng)放大檢測的響應(yīng)信號，并引入復(fù)合抗體作為二次抗體，使該傳感器對大腸桿菌的檢測限由106cfu·mL-1下降到105cfu·mL-1[8]。

表面等離子共振生物傳感器（Surface plasmon resonance，SPR）依據(jù)表面等離子共振原理，將已知的生物分子固定在50nm的Au膜表面,加入與其互補的目標(biāo)生物分子，在應(yīng)用SPR生物傳感器的過程中，兩者結(jié)合（雜交）將使Au膜與溶液界面的反射光強度變化，折射率上升，從而導(dǎo)致共振角改變，根據(jù)共振角的改變程度，由光電探測器檢測這種連續(xù)變化，進(jìn)而分析被測物的濃度[9-14]。與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)如超速離心、熒光法、熱量測定法等相比，SPR生物傳感器具有如下顯著特點:①樣品需要量極少，一般一個表面僅需約1μg蛋白配體；②檢測過程方便快捷，靈敏度高；③大多數(shù)情況下，不需對樣品進(jìn)行預(yù)處理；④由于SPR是基于對未穿透樣品的反射光的測量，所以檢測能在混濁的甚至不透明的樣品中進(jìn)行。

由于生物傳感器具有這些優(yōu)點，適用于對發(fā)酵液進(jìn)行細(xì)菌檢測。但目前國內(nèi)外研制的SPR監(jiān)測分析系統(tǒng)基本上都是大型專業(yè)化儀器，存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、體積龐大、成本高、不能用于現(xiàn)場在線監(jiān)測等缺點，大多局限于實驗室內(nèi)使用，并且各大公司研究的主流方向是開發(fā)通用型的高精尖實驗室儀器，針對對象主要是科研單位和大型制藥公司等，不能滿足發(fā)酵食品在線檢測的要求[15]。因此，研究一種小型SPR檢測儀器，使之能夠滿足高靈敏、現(xiàn)場在線和低成本的檢測要求，既符合市場需求，也具有十分重要的社會和經(jīng)濟意義。

1 生物傳感器連續(xù)取樣和檢測裝置設(shè)計思路

由于SPR生物傳感器的高靈敏性對實驗人員的操作要求很高，人工操作時的抖動、每次檢測時傳感器固定位置的不確定等都不可避免的對檢測結(jié)果造成影響；并且操作人員直接接觸含有細(xì)菌的樣品會造成自身安全隱患，并且易污染樣品。所以，針對實際檢測時存在上述的問題，結(jié)合SPR生物傳感器檢測樣品時的工藝要求，對取樣檢測裝置進(jìn)行設(shè)計。具體流程見圖1。

圖1 SPR生物傳感器檢測微生物的流程Fig.1 Flow of microbial detection by SPR Biosensor

設(shè)計的裝置與SPR生物傳感器相配合用以檢測酸菜液內(nèi)微生物的含量，其工作過程及結(jié)構(gòu)與檢測工藝流程相匹配，從而實現(xiàn)從人工操作到自動操作的轉(zhuǎn)化。應(yīng)用SPR生物傳感器檢測的操作步驟如圖1所示，在符合檢測原理的前提下，要保證各測定步驟的連續(xù)性。

2 儲液檢測裝置的結(jié)構(gòu)設(shè)計

SPR生物傳感器的檢測主要有浸泡和流通池兩種方法，由于流通池法的液體進(jìn)出管口徑較?。ㄒ妶D2中的上、下兩根黑色塑料管），對被檢測液體要求很高，如含有大顆粒物質(zhì)極易堵塞管路，檢測范圍受到限制，因此本設(shè)計采用浸泡法。

圖2 帶有流通池的傳感器頭Fig.2 Sensor head with a flow cell

綜合各方面因素，利用浸泡式檢測形式的特點，模仿人手操作的結(jié)構(gòu)，結(jié)合SPR生物傳感器的檢測工藝流程，對儲液檢測裝置進(jìn)行設(shè)計，具體結(jié)構(gòu)如圖3所示。本儲液檢測裝置的主要結(jié)構(gòu)包括:

①定位及取樣機構(gòu) 固定SPR生物傳感器，實現(xiàn)SPR生物傳感器的浸泡式檢測。

②儲液機構(gòu) 與SPR生物傳感器的檢測過程相配合，并且轉(zhuǎn)動方向與檢測步驟相同。

③傳動機構(gòu) 將檢測步驟與傳感器運動相連接，保證SPR生物傳感器的運動過程與檢測步驟相配合，完成浸泡式檢測。

圖3 SPR生物傳感器檢測裝置總體結(jié)構(gòu)Fig.3 Overall structure of SPR biosensor detection device

2.1 定位夾持機構(gòu)的設(shè)計

SPR生物傳感器的浸泡式檢測需要人手固定扶持，在檢測過程中，人手會產(chǎn)生生理性抖動，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與精度。針對這些問題，本裝置設(shè)計定位夾持機構(gòu)，本機構(gòu)是模仿人手捏住的方式進(jìn)行夾持，添加定位片對傳感器的位置進(jìn)行固定，可以防止在檢測過程中因晃動影響檢測結(jié)果。由圖4可知，傳感器頭的外形、厚度較小，外殼為非金屬材料、硬度較小，易受到損壞，且浸泡式檢測時要求金膜（圖4中部矩形區(qū)域）為水平狀態(tài)，所以設(shè)計中采用彈簧柔性夾緊，夾緊力施加在傳感器頭的插座上，并且增設(shè)定位片進(jìn)行定位，具體設(shè)計方案如圖5所示。

定位夾持機構(gòu)包括四部分:上夾具、下夾具、定位片和扭轉(zhuǎn)彈簧。通過扭轉(zhuǎn)彈簧將上下夾具連接，利用彈簧的彈性形變的特性，實現(xiàn)對傳感器的夾緊。定位夾緊機構(gòu)的設(shè)計在保證傳感器頭使用穩(wěn)定的同時，提高了其傳感作用區(qū)的定位檢測精度。從而進(jìn)一步保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖4 傳感器頭及其插座Fig.4 Sensor head and its socket

圖5 夾具定位夾持機構(gòu)Fig.5 Structure of positioning fixture

2.2 連續(xù)取樣機構(gòu)的設(shè)計

連續(xù)取樣機構(gòu)是保證整個裝置準(zhǔn)確檢測的核心部分，作用是配合各檢測步驟，適時升降傳感器頭，完成傳感器浸入法檢測過程。SPR傳感器作用區(qū)的面積較小，且在檢測時要求傳感器穩(wěn)定升降，并使傳感器頭浸入到液面下要求的深度，考慮到傳感器的運動方式和運動穩(wěn)定性，選擇螺桿螺母副的滑動螺旋傳動方式，主要參數(shù)為:公稱直徑20 mm，螺紋長度40 mm，旋向為右，節(jié)距4 mm，螺母厚度10 mm，從而保證運動過程穩(wěn)定性和檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。

具體設(shè)計方案（見圖5（b）、6和7）:

圖6 螺桿螺母傳動結(jié)構(gòu)Fig.6 Schematic diagram of screw drive

圖7 導(dǎo)軌與夾具座配合Fig.7 Block diagram with rails and fixtures

①選用的梯形螺紋的強度和對中性較好，可以消除因磨損而造成的間隙，這樣既可以增加傳感器升降的穩(wěn)定性，同時又能較好的保證升降位移的準(zhǔn)確性（圖5（b）和圖6中的螺紋）。

②螺母一側(cè)采用T型結(jié)構(gòu)（見圖6），使螺母僅具有1個自由度，即沿軸向的移動，保證了同軸的對中性。

③設(shè)計有與夾具T型結(jié)構(gòu)相配合的T型導(dǎo)軌（如圖5（b）和圖7所示），對螺母起到導(dǎo)向作用，同時限制了螺桿（即絲杠傳動軸）的撓性變形，起到了間接固定螺桿的作用。

④從實用性和強度要求方面考慮，螺桿材料采用強度和硬度較高的尼龍，螺母選用相對較軟的聚四氟乙烯（F4）材料，這樣可滿足裝置質(zhì)量和檢測工藝的要求。

如圖6和圖7所示，連續(xù)檢測機構(gòu)包括三部分:傳感器夾具座、絲杠齒輪傳動軸和導(dǎo)軌。傳感器夾具座通過內(nèi)螺紋與絲杠齒輪軸上部的螺桿相配合，通過絲杠齒輪軸的往復(fù)轉(zhuǎn)動，帶動傳感器夾具座實現(xiàn)上升和下降運動，夾具座上裝有SPR傳感器的定位夾持機構(gòu)，從而實現(xiàn)了SPR生物傳感器的浸泡式檢測方法。傳感器夾具座上的T型結(jié)構(gòu)與導(dǎo)軌上的T型槽相配合的，通過固定導(dǎo)軌，對夾具座起到約束作用，使其只能軸向運動，保證傳感器運動的精確性。

2.3 儲液機構(gòu)的設(shè)計

設(shè)計儲液機構(gòu)時，主要解決兩方面問題:材料選擇、與SPR生物傳感器配合方式確定。儲液機構(gòu)盛裝的液體，除了待檢測的樣品外，還有生物和化學(xué)試劑。因此既要防止承載器具污染試劑，還要避免試劑腐蝕器具。通過分析多種材料的耐腐及強度特性，選擇F4作為儲液機構(gòu)的材料。F4具有較強的防腐性能，還可以融入其他材質(zhì)加強其硬度和強度，以滿足承載等方面的要求。

儲液機構(gòu)的結(jié)構(gòu)特點:采用圓盤結(jié)構(gòu)（見圖8），配有與檢測步驟數(shù)相同的儲液槽（15個槽），通過棘輪結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)動帶動其旋轉(zhuǎn)參數(shù)為:齒數(shù)15 mm，模數(shù)4 mm，齒距15.57 mm，齒高3.5 mm，頂圓直徑60 mm。實現(xiàn)單向周期循環(huán)運動。棘輪有15個齒，與儲液盤的槽數(shù)相同，并且二者之間為過盈配合，這使得棘輪每轉(zhuǎn)過一個齒，儲液盤恰好轉(zhuǎn)過一個儲液槽，這樣既實現(xiàn)了與SPR生物傳感器檢測順序的配合，又避免了試劑的頻繁更換。

只在存放待檢測樣品的槽上設(shè)置注液口，可以在一個樣品檢完排出后，直接注入下一個待檢樣品，這樣可避免人手直接接觸待檢測樣，保證了操作人員的安全，同時又防止樣品的污染。

圖8 儲液機構(gòu)Fig.8 Diagram of reserve liquid mechanism

2.4 傳動機構(gòu)的設(shè)計

2.4.1 結(jié)構(gòu)的分析

傳動機構(gòu)是整個裝置的執(zhí)行部分，可實現(xiàn)SPR生物傳感器的往復(fù)運動與儲液盤單向轉(zhuǎn)動相配合，保證實現(xiàn)浸入式檢測。圖9是螺旋傳動、齒輪傳動和棘輪相結(jié)合的多級傳動結(jié)構(gòu)簡圖。運動和轉(zhuǎn)矩由輸入軸（絲杠齒輪軸）輸入，輸入軸上固結(jié)有螺桿和輸入齒輪Z1，螺桿帶動螺母上下移動，齒輪Z1帶動齒輪Z2，Z2固結(jié)在傳動軸1（一級傳動齒輪軸）上，同時使固結(jié)在傳動軸1上的齒輪Z3轉(zhuǎn)動，Z3帶動固結(jié)在傳動軸2（二級傳動齒輪軸）上的齒輪Z4轉(zhuǎn)動，驅(qū)使鉸鏈在Z4上的棘爪與其一起運動，并推動空套在傳動軸2上棘輪轉(zhuǎn)動，從而使與棘輪相連的儲液盤相應(yīng)轉(zhuǎn)動。通過輸入軸順、逆兩向轉(zhuǎn)動，從而實現(xiàn)夾具的上升與下降。傳動機構(gòu)的傳動原理如圖10所示。由于整個傳動輸入為往復(fù)運動，而輸出為單向運動，因此，輸出端采用棘輪機構(gòu)，從而實現(xiàn)步進(jìn)的間歇運動，當(dāng)輸入軸反向轉(zhuǎn)動、夾具上升時，止回棘爪制動棘輪，最終使儲液盤只能單向旋轉(zhuǎn)。

圖9 多級傳動Fig.9 Multi-level transmission

圖10 多級傳動原理分析Fig.10 Analysisof multi-level driving principle

2.4.2 傳動比及運動分析

傳動機構(gòu)工作時，夾具每升降1次儲液盤轉(zhuǎn)過1個槽，棘輪設(shè)計有15個棘齒以配合儲液盤的15個槽?？紤]到整個裝置的結(jié)構(gòu)尺寸、夾具的升降位移以及穩(wěn)定性等因素，選擇螺桿傳動（螺桿具體參數(shù)見表1），每轉(zhuǎn)動2周，夾具上升或下降1次，因齒輪傳動精度高、穩(wěn)定性好，所以采用此傳動方式進(jìn)行多級傳動，總傳動比為30。各齒輪之間的傳動嚙合、速度關(guān)系如圖10所示。

根據(jù)傳動誤差和回差最小的原則，確定最佳傳動級數(shù)為:

一般單級傳動級數(shù)不超過8，圓整n到接近的整數(shù)值，即取n=2。

輸入齒輪Z1與齒輪Z2間的傳動比為:

式中:z1，z2-分別為齒輪Z1和Z2的齒數(shù)。

式中:z3，z4-分別為齒輪Z3和Z4的齒數(shù)；

且整個傳動系統(tǒng)的總傳動比為:

從傳動的平穩(wěn)性及精度方面考慮，兩級傳動比差距不宜過大，故選擇i12=5，i34=6。根據(jù)機械設(shè)計手冊要求，一般漸開線圓柱直齒輪z1常用取值范圍為17≤z1≤28，取z1=20。各齒輪的具體參數(shù)如表3，這樣可以確定齒輪上各嚙合點及連接點的速度關(guān)系。圖10中O4點為棘爪在齒輪Z4上位置。

表1 各齒輪傳動的參數(shù)Table1 Parameters of the gear drive

2.5 控制系統(tǒng)的設(shè)計

對上述各部件進(jìn)行組裝，得到如圖11所示的檢測裝置，通過自行設(shè)計的單片機控制系統(tǒng)，可以按照試驗步驟要求實現(xiàn)自動檢測。整套控制系統(tǒng)由電機驅(qū)動模塊、微控制器模塊、顯示模塊、按鍵、電源及步進(jìn)電機等部分組成（見圖11中13-18），通過編程控制電機的正反轉(zhuǎn)及間歇時間，實現(xiàn)與試驗步驟相配合的自動檢測目的，并且通過按鍵可以根據(jù)需要對間歇時間進(jìn)行調(diào)整。在自動運行時能通過顯示屏直觀的觀察檢測系統(tǒng)運行情況，能夠手動停止。

圖11 檢測裝置及控制系統(tǒng)實物Fig.11 Physical chart of the detecting device and control system

3 酸菜液中大腸桿菌濃度測定

3.1 試驗?zāi)康募胺椒?/h3>

應(yīng)用本套裝置與SPR生物傳感器器相配合，對隨機選取的酸菜液進(jìn)行大腸桿菌（E.coli O157）含量的檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，得出其中大腸桿菌E.coli O157的濃度值，并與實驗室常規(guī)方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，驗證測量結(jié)果的準(zhǔn)確性及裝置的可用性。

3.2 試驗內(nèi)容

3.2.1 試驗方法與步驟

采用美國Texas Instruments公司生產(chǎn)的集成化手持式SpreetaTMSPR傳感器。將事先配制好的試劑裝入儲液盤相應(yīng)的槽內(nèi)，把傳感器固定于傳感器夾具上，調(diào)試好后，實施如下檢測步驟:

①校準(zhǔn)傳感器，在空氣中的index值為0；

②去離子水中的index值為1.333。

③清洗傳感器金膜表面，將傳感器金膜表面浸入10mL 0.1 mol·L-1NaOH in H2O溶液中3 min；

④將傳感器浸入10mL磷酸鹽緩沖液（PBS）3 min；

⑤結(jié)合親和素，將傳感器浸入10mL親和素（NeutrAvidin）3 min；

⑥沖洗過量的親和素（NeutrAvidin），將傳感器浸入10mL PBS 3 min；

⑦結(jié)合抗體，將傳感器浸入10mL 300μg·mL-1生物素化抗體（Antibody）中10 min；

⑧沖洗游離的抗體，將傳感器浸入10mL 0.1 mol·L-1NaOH in PBS中2 min；

⑨將傳感器浸入10mL 0.1 mol·L-1NaOH in PBS中2 min；

⑩將傳感器浸入10mL牛血清白蛋白（BSA）中2 min；

試驗各步驟之間的轉(zhuǎn)換及檢測時間通過本裝置的控制系統(tǒng)自動控制，待檢測樣品通過系統(tǒng)控制由管路定時注入，無需人手工操作。其中1號樣品的監(jiān)測曲線如圖12所示。

圖12 1號樣品的監(jiān)測曲線Fig.12 Detection curve of sample 1

3.2.2 驗證實驗

采用國標(biāo)GB4789.2-94中提到的常規(guī)檢測方法-平板菌落計數(shù)法（細(xì)菌總數(shù)的測定），對同一樣品進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果作為實際值。在無菌操作臺內(nèi)將待測樣品做10倍稀釋，選取1∶1000、1∶10000和1∶100000這三個稀釋度，每個稀釋度都做了2個平行樣。每個樣品的菌落總數(shù)的稀釋度選取原則和菌落總數(shù)的詳細(xì)計數(shù)方法，具體參見國標(biāo)GB4789.2-94。最終得到6組實際值。

3.3 試驗結(jié)果與討論

將檢測試驗得到的6組測量值與驗證實驗得到的6組實際值進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表2所示。

表2 試驗數(shù)據(jù)分析Table2 Analysis of test data

通過分析結(jié)果可知，誤差值小于5%，說明測量值較準(zhǔn)確，應(yīng)用本套裝置檢測酸菜液內(nèi)大腸桿菌E.coli O157是準(zhǔn)確的、可信的。

4 結(jié)論

本文針對現(xiàn)階段發(fā)酵食品在線檢測存在的問題，分析應(yīng)用SPR生物傳感器檢測的優(yōu)越性，結(jié)合其檢測工藝要求，研制了一個連續(xù)取樣檢測裝置。提出了一種多傳動方式相結(jié)合的傳動機構(gòu)-滑動螺旋傳動、齒輪傳動和棘輪間歇運動機構(gòu)。討論了其傳動原理和具體機構(gòu)的實現(xiàn)形式，給出了實用的傳動結(jié)構(gòu)。將傳感器頭的直線升降往復(fù)運動與儲液盤的圓周單向轉(zhuǎn)動相連接，實現(xiàn)周期性循環(huán)檢測的性能。通過應(yīng)用自行設(shè)計的控制系統(tǒng)，減少了人工操作，基本實現(xiàn)了從人工操作向自動化檢測的轉(zhuǎn)化。并且應(yīng)用本裝置對酸菜發(fā)酵液中大腸桿菌E.coli O157的濃度進(jìn)行了檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行驗證，誤差值小于5%，證明了本裝置的可用性。

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