劉艷艷，秦 光，李繼昌

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

植物血凝素（Phytohaemagglutinin，PHA）是從蕓豆種子中提取的植物糖蛋白，具有廣譜抗病毒和增強機體的免疫力的作用，是一種藥用價值較高的生物產(chǎn)品，在臨床上可以與許多藥物同時使用，具有協(xié)同或相加作用，能明顯提高藥物的療效；植物血凝素無種屬特異性，可廣泛用于家禽[1]、豬[2]、牛等動物以增強免疫力；也可以與疫苗同時使用，起到彌補免疫空白期、緩減疫苗應(yīng)激反應(yīng)和增強免疫效果的作用。

反膠束提取蛋白質(zhì)是近十多年興起的一種新型分離技術(shù)，具有生產(chǎn)周期短、處理量大、溶劑可循環(huán)使用、蛋白質(zhì)純度及萃取率均較高、可連續(xù)操作等許多優(yōu)點而受到關(guān)注[3-8]。但在前萃取時，操作順序存在一定差異，磨禮現(xiàn)等采用鹽溶液飽和的反膠束體系與原料粉混合提取[3]，Nascimento等采用原料、鹽溶液、反膠束同時混合提取[9]。本文采用琥珀酸二辛脂磺酸鈉/異辛烷形成的反膠束體提取水溶液中的PHA，對前萃取的操作順序及方法進行初步的研究，考察影響PHA前萃的因素，根據(jù)正交試驗確定最佳前萃工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕓豆（購于哈爾濱市某大型超市產(chǎn)地為黑龍江?。瑢⑵浞鬯闉?0目細粉；AOT（Fluka公司產(chǎn)品，批號138115844108164）；血清白蛋白（Biotech Grade，批號A0332）；聚乙二醇20000（國藥集團，批號F20061106）；氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、異辛烷等均為分析純，所用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-7504紫外-可見分光光度計（上海精科儀器）；FW-135中草藥粉碎機（天津泰斯特）；KQ3200E型超聲波儀（昆山市超聲儀器廠）；HY-6型多頭磁力攪拌器（江蘇省榮華儀器制造有限公司）；FA2004型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；3K15型低溫離心機（Sigma公司）。

1.3 PHA的提取方法

采用反膠束法提取PHA，以提取物的血凝效價為主要參考指標，并結(jié)合蛋白質(zhì)濃度，確定最佳提取方法，在保證后萃過程不變的情況下，進行鹽的種類與濃度、萃取時間、AOT濃度的前萃單因素考察，設(shè)計正交試驗，最后確定最佳前萃方法。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SAS軟件處理。

1.3.1 提取方法一

正萃:取蕓豆細粉3 g，經(jīng)石油醚脫脂干燥，干燥粉末與 0.15 mol·L-1氯化鈉溶液（pH 5）按1∶5（W/V）混合，立即加入與氯化鈉溶液等體積的反膠束溶液（0.04 g·L-1AOT/異辛烷澄清液），在磁力攪拌器上攪拌5 min，然后5000 r·min-1離心5 min，取上層油相。

反萃:加入與上所得油相等體積的0.15 mol·L-1氯化鈉溶液（pH 9），磁力攪拌 5 min，5000 r·min-1離心5 min，PHA被反萃至水相，取水相透析除鹽，即得PHA，將提取液用聚乙二醇20000進行濃縮，定容至2mL，待測。

1.3.2 提取方法二

正萃:蕓豆細粉3 g經(jīng)石油醚脫脂干燥，與0.15 mol·L-1氯化鈉溶液（pH 5）按1∶5（W/V）混合5 min后，加入等體積反膠束體系，在磁力攪拌器上攪拌5 min，然后5000 r·min-1離心5 min，取上層油相。

反萃同1.3.1。

1.3.3 提取方法三

反膠束溶液的制備:0.04 g·L-1AOT/異辛烷，按摩爾體積比稱適量AOT溶于相應(yīng)體積的異辛烷中。在磁力攪拌器的作用下，用注射器向AOT/異辛烷溶液中逐漸加入0.15 mol·L-1氯化鈉溶液，待攪拌均勻后，使在反膠束溶液中增溶水和表面活性劑的摩爾比率參數(shù)W0為20。

正萃:蕓豆細粉3 g經(jīng)脫脂干燥后與反膠束溶液直接攪拌5 min，其他操作同上。

1.3.4 提取方法四

與1.3.1方法相似，將原方法的磁力攪拌法換成超聲處理5 min，其他操作同上。

1.4 蛋白質(zhì)含量測定標準曲線的建立

選用用BSA作標準蛋白，將其配制成不同濃度，即0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg·mL-1，于280nm處測吸光度值，并繪制標準曲線。

1.5 血凝效果檢查

1.5.1 2%雞紅細胞懸液的制備

雞翅靜脈無菌采取抗凝血。用生理鹽水洗滌3次，每次2000 r·min-1離心10 min，按紅細胞壓積用生理鹽水配成2%的紅細胞懸液。

1.5.2 血凝試驗

在96孔V型血凝板中，每孔加入25μL生理鹽水。在各排第1孔內(nèi)分別加入待檢測溶液25μL，混勻后從第1孔吸取25μL加入第2孔，混勻后再吸取25μL加入第3孔，按此方法倍比稀釋到第11孔，混勻后吸取25μL棄掉。第12孔作空白對照。再在每孔內(nèi)加入25μL紅細胞懸液，水平搖動，放置37℃溫箱內(nèi)15 min。根據(jù)紅細胞凝集程度判定結(jié)果，50%紅細胞凝集的最高稀釋倍數(shù)做為判定凝集價的終點，效價以Log2表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白含量測定標準曲線的建立

根據(jù)蛋白質(zhì)類成分的含量測定方法[9]，于280nm處測定提取液的吸光度值，以蒸餾水作對照。制得標準曲線，Y=0.606X+0.05，R=0.9998（見圖1）。

圖1 BSA標準曲線Fig.1 Standard curve of BSA

2.2 不同提取方法對PHA前萃的影響

在采用反膠束提取蛋白質(zhì)類成分時，在方法及提取順序上有一定的不同，本文對PHA前萃過程進行考察，結(jié)果見表1，可見在其他條件不變的情況下，不同的提取方法具有顯著性差異，方法一中提取物中的血凝現(xiàn)象最明顯，蛋白質(zhì)含量也顯著性高于其他方法，方法二和方法四沒有差別，方法三提取效果相對較差，說明在PHA的反膠束法提取過程中，制備反膠束溶液的不同方法及正萃溶液的不同混合順序?qū)μ崛∮幸欢ǖ挠绊憽?/p>

表1 不同提取方法結(jié)果Table1 Results of different extractions methods （n=3）

2.3 AOT濃度對PHA前萃的影響

表面活性劑濃度是影響反膠束形成的重要因素[5]。在表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度只有超過其臨界膠束濃度時，溶液中才能自發(fā)的形成反膠束。根據(jù)膠束形成的質(zhì)量作用定律，增加表面活性劑的濃度將使有機相中膠束聚集的數(shù)目增加，即量的增加，導(dǎo)致反膠束相的萃取容量隨表面活性劑濃度的增大而提高[3]。

本試驗中不同的AOT濃度對前萃效果的影響見表2，理論上提取率應(yīng)隨著AOT濃度的增加而增加，但當其濃度在0.04、0.06 g·L-1時，血凝效價顯著性高于其他濃度，其蛋白質(zhì)含量也顯著性提高，推測因PHA的分子質(zhì)量較大為130 ku，隨著AOT濃度的增加，有機相異辛烷的容積是固定的，可能使反膠束直徑變小，致使為增溶量減少，降低提取效率。

2.4 提取時間對PHA前萃的影響

提取時間的不同會影響PHA進入膠束的量，其結(jié)果見表3，隨著萃取時間的延長，血凝效價在30 min時最低，隨后又開始回升，蛋白質(zhì)含量也有相似的趨勢，說明PHA在反膠束中的濃度與并非與萃取時間成正比，具體原因待進一步研究。

表2 AOT不同濃度的提取結(jié)果Table2 Results of extractions of different AOT concentration （n=3）

表3 不同提取時間結(jié)果Table3 Results of different extractions time （n=3）

2.5 鹽的種類及濃度對PHA前萃的影響

鹽離子種類和濃度主要影響蛋白質(zhì)與表面活性劑極性基團之間的靜電作用力，PHA的傳統(tǒng)提取方法中經(jīng)常采用氯化鈉溶液提取，在反膠束中，不同鹽的種類及不同濃度對PHA前萃的影響見表4，隨著氯化鈣與氯化鉀的濃度增加，蛋白質(zhì)的含量呈下降趨勢，效價也呈下降趨勢，而氯化鈉濃度在0.15 mol·L-1時，蛋白含量最高，血凝效價最高，因此確定最佳鹽為氯化鈉。

表4 鹽的種類及不同濃度的提取結(jié)果Table4 Results of extractions of different salts and different concentration （n=3）

2.6 正交設(shè)計

根據(jù)單因素考察的結(jié)果，以血凝效價為指標，選三個因素做正交設(shè)計，各因素編碼值及試驗設(shè)計和試驗結(jié)果分別見表5～9。

表5 L9(33)正交試驗設(shè)計因素及水平Table5 Factors and levels of L9(33)orthogonal test （n=3）

表6 HA L9(33)正交試驗效價結(jié)果Table6 Results of L9(33)orthogonal test and range analysis of titer

表7 正交試驗效價方差分析Table7 Analysis of variance(ANOVA)for the results of orthogonal test of valence

表8 L9(34)正交試驗蛋白質(zhì)濃度結(jié)果Table8 Results of L9(34)orthogonal test and range analysis of protein concentration （n=3）

表9 正交試驗方差蛋白質(zhì)濃度分析Table9 Analysis of variance(ANOVA)for the results of orthogonal test of protein concentration

表6、8的極差分析表明，AOT濃度的影響最大，表7、9也證明了這一點，其次為萃取時間和氯化鈉濃度，結(jié)合蛋白質(zhì)濃度的變化，最佳提取方案為A2B1C1，即以AOT濃度為0.05 g·mL-1，氯化鈉濃度為0.10 mol·L-1，攪拌提取5 min，試驗方案四為最佳方案。

3 討論

PHA的提取一般采用緩沖液、鹽溶液等浸泡24 h等[11]，具有時間長、易霉變等缺點，本文的提取方法使提取時間大大減少。

在PHA的提取相關(guān)文獻[11]中，單以血凝效價為指標，本文以血凝效價及蛋白質(zhì)濃度作為雙重考察指標考察提取效果，更為全面。程小麗等曾對超聲萃取大豆蛋白技術(shù)進行研究[12]，但并未與傳統(tǒng)的攪拌方法相比較，在本文的PHA不同提取方法試驗中，雖然超聲法提供了較強的萃取動力，但在超聲過程中，易造成溶劑的分層，致使溶劑與原料的接觸面減少，所以單純的超聲萃取效果較差；提取方法三是國內(nèi)應(yīng)用較多的萃取蛋白質(zhì)的方法[3,12]，經(jīng)本文初步驗證不適合PHA的提?。环椒ㄒ慌c二是在萃取順序上的差異，結(jié)果表明鹽溶液與反膠束同時與原料混合效果好，與文獻[9]的方法一致。

4 結(jié)論

采用AOT/異辛烷形成的反膠束萃取PHA的方法是可行的；在PHA的前萃過程中，其萃取效果受到萃取時間、AOT濃度及鹽的種類及濃度等因素影響，在5～120 min的時間范圍內(nèi)，與萃取時間成反比，其原因待進一步研究,，采用反膠束方法提取PHA時，以AOT濃度為0.05 g·mL-1，氯化鈉濃度為0.10 mol·L-1，攪拌提取5 min的效果最好。

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