韓廣明, 高曉蘭, 牛嗣云, 高福祿

(1.承德醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院, 河北 承 德 067000 2.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 河北 保 定 071000 3.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北 石家莊 050016)

本研究建立 D-半乳糖所致亞急性衰老大鼠模型,通過(guò) Morris水迷宮行為測(cè)試;放射免疫法測(cè)定下丘腦 GnRH、P物質(zhì)、β-內(nèi)啡肽的含量,探討何首烏飲抗腦衰老的機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及分組：選用清潔級(jí) 8周齡 SD大鼠 80只,雌雄各半,體重 180-220g(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。用生理鹽水將 D-半乳糖配成 6%的溶液,按 300mg/kg.d給藥,除正常組(N)10只外,其余大鼠連續(xù)腹腔注射 60 d,每天一次,建立衰老動(dòng)物模型。然后進(jìn)行 Morris水迷宮行為測(cè)試。潛伏期成績(jī)與正常組比較明顯延長(zhǎng),表明模型建立成功。然后將衰老大鼠隨機(jī)分為模型組(M)10只、何首烏飲延緩衰老高劑量(Tg)、中劑量(Tz)、低劑量(Td)各 10只、自然恢復(fù)組(S-R)10只。何首烏飲組空腹灌胃何首烏飲,按體重每 100g給 0.4mL計(jì)算灌藥量,自然恢復(fù)組每天灌胃等量的生理鹽水,連續(xù) 60 d,每天一次。然后何首烏飲延緩衰老組(高、中、低)劑量組、自然恢復(fù)組進(jìn)行 Morris水迷宮行為測(cè)試。

1.2 藥物溶液的制備：何首烏飲方劑組成：何首烏(炙)、肉蓯蓉 、懷牛膝、淫羊霍 、丹參 、茯苓等按重量比3：2：3：2：5：3比例混合,剪碎,水浸泡 1 h,然后水煎 2次,每次 30m in,過(guò)濾后濃縮至含生藥分別為 2.4、4.8、9.6 g/m L(分別作為低、中、高劑量藥液)。4℃保存,給藥前復(fù)溫至 25-30℃。

1.3 Morris水迷宮行為測(cè)試：各組大鼠做 Morris水迷宮測(cè)試,定位航行試驗(yàn)用于測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。在連續(xù)訓(xùn)練 5 d,每天訓(xùn)練 4次,每次隨機(jī)選擇一個(gè)象限作為入水點(diǎn),觀察并記錄大鼠爬上平臺(tái)的軌跡圖、游泳速度及所需時(shí)間(潛伏期)。如果大鼠在60s內(nèi)未找到平臺(tái),需將其引導(dǎo)至平臺(tái)并在平臺(tái)上站20 s,此時(shí)潛伏期記為 60 s。每只大鼠的訓(xùn)練間隔為 1 h。空間探索試驗(yàn)考察大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶能力。訓(xùn)練第 6天上午撤除平臺(tái),將大鼠隨機(jī)從某一象限池壁中點(diǎn)面向池壁放入水中,記錄 60 s穿越平臺(tái)部位的次數(shù)。

1.4 標(biāo)本處理：大鼠用 10%的水合氯醛麻醉,斷頭取出腦組織,迅速投入到液氮中待用。

1.5 下丘腦 GnRH、SP和 β-EP含量的測(cè)定：從液氮中取出全腦,用直徑 2.5 mm的套管刀在大鼠腦腹側(cè)視交叉后方打孔取下丘腦,組織柱長(zhǎng)約 5mm,取一半迅速稱重(約 15 mg)后于 0.5m L 100℃的生理鹽水(沸水浴)中煮沸 3min,加 0.1N鹽酸 0.5mL于勻漿器中制成勻漿,置 4℃1-2 h,再用 0.1N的 NaOH 0.5 m L中和(pH在 6.9-8.4),用 4℃離心機(jī)離心 3000 rpm 30min。取上清液。用放射免疫測(cè)定法分別檢測(cè)GnRH、SP、β -EP。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮行為測(cè)試

2.1.1 各組大鼠潛伏期成績(jī)比較：前 2d各組的成績(jī)無(wú)顯著性差異,隨學(xué)習(xí)時(shí)間的延長(zhǎng)各組潛伏期均逐漸縮短,連續(xù) 5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組、自然恢復(fù)組的潛伏期成績(jī)與正常組比較明顯延長(zhǎng)(P＜0.01),表明模型建立成功,模型組、自然恢復(fù)組的潛伏期成績(jī)無(wú)差別(P＞0.05)。何首烏飲組第 3天后的潛伏期與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。其中何首烏飲高劑量組明顯好于其余各組(P＜0.05),見(jiàn)表 1。

表 1 各組大鼠在定位航行試驗(yàn)中平均逃避潛伏期的比較(±s,n=8)

表 1 各組大鼠在定位航行試驗(yàn)中平均逃避潛伏期的比較(±s,n=8)

vs M：1)P＜0.01,2)P＜0.05;vs Tw：3)P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天N 52.32±10.04 43.40±12.601) 22.16±5.661)3) 16.23±6.601)3) 8.91±1.591)3)M 57.26±2.50 51.25±3.45 41.75±13.893) 34.84±3.073) 30.05±6.393)Tg 55.12±10.19 42.49±10.881) 26.28±9.661) 18.23±3.621) 9.71±1.511)3)Tz 55.89±10.08 42.19±4.331) 28.33±9.661) 25.29±7.301) 15.91±5.221)3)Td 56.11±7.08 43.66±11.391) 30.16±9.111) 23.11±8.161) 22.11±7.121)S-R 56.77±2.97 47.69±5.25 39.75±6.443) 33.33±6.023) 26.07±3.361)3)

2.1.2 各組小鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果：正常組穿越平臺(tái)的次數(shù)(7.11±1.36)次/min,明顯高于模型組(2.36 ±0.38)次 /m in、自然恢復(fù)組(2.69 ±0.29)次/min(P＜0.01);模型組與自然恢復(fù)組穿越平臺(tái)的次數(shù)無(wú)明顯差別(P＞0.05);何首烏飲高組(6.93±1.06)次 /min、中組 (4.29 ±1.99)次 /min、低組(3.71±1.77)次/min穿越平臺(tái)的次數(shù)與模型組比較顯著增多(P＜0.01)。其中何首烏飲高劑量組次數(shù)明顯多于其余各組(P＜0.05)。

2.2 下丘腦 GnRH、SP和 β-EP含量

2.2.1 下丘腦 GnRH、SP含量：模型組下丘腦 GnRH、SP明顯增高,與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01),何首烏飲可改善下丘腦 GnRH、SP的分泌。何首烏飲高劑量組要好于其他各組(P＜0.05),見(jiàn)表 2。

2.2.2 下丘腦 β-EP含量：模型組下丘腦 β-EP明顯降低,與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01),何首烏飲可改善下丘腦 β-EP的分泌。何首烏飲高劑量組要好于其他各組(P＜0.05),見(jiàn)表 2。

表 2 各組大鼠下丘腦 GnRH、SP、β-EP含量的比較(±s,n=5)

表 2 各組大鼠下丘腦 GnRH、SP、β-EP含量的比較(±s,n=5)

vs M：1)P＜0.05,2)P＜0.05;Tw：3)P＜0.05

)N 289.11±23.161)3) 3.71±1.421)3) 22.44±2.341)3)M 543.66±19.953) 6.11±2.773) 13.34±2.483)Tg 302.94±13.511)3) 3.73±0.311)3) 24.34±1.481)3)Tz 403.68±37.991)3) 4.70±1.091) 19.78±1.961)3)Td 520.33±47.193) 5.23±0.052) 16.54±3.132)S-R 570.94±32.003) 6.89±0.413) 12.09±1.47

3 討 論

人類衰老的主要表現(xiàn)是精力衰退、智力下降、記憶力下降;目前研究表明：腦內(nèi)存在著調(diào)控衰老的結(jié)構(gòu)和機(jī)制,稱為“衰老鐘”,下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)可能就是“衰老鐘”的所在部位[1]。

在衰老過(guò)程中,下丘腦出現(xiàn)的一系列結(jié)構(gòu)和功能的改變是導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂的主要原因。Urban[2]研究發(fā)現(xiàn)：下丘腦神經(jīng)元分泌單胺類神經(jīng)遞質(zhì)活性下降與性腺軸衰老有關(guān)。下丘腦產(chǎn)生多種神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)肽均參與了 GnRH(gonadotrop h in hormone-releasing hormone)合成和分泌的調(diào)節(jié),并共同完成機(jī)體對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)[3]。衰老時(shí)下丘腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)肽的含量發(fā)生相應(yīng)的增齡變化,其平衡遭到破壞,并與一些老年疾病如帕金森病、老年癡呆及腦功能減退有關(guān)[4-6]。本研究證明,衰老大鼠下丘腦GnRH、P物質(zhì)(Substance P,SP)的含量均增高,而下丘腦 β-內(nèi)啡肽(β-endorphine,β-EP)含量代償性下降。改善中樞神經(jīng)遞質(zhì)的代謝可顯著彌補(bǔ)或扭轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)記憶的障礙[7]。本實(shí)驗(yàn)顯示何首烏飲可明顯改善衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及下丘腦 GnRH、SP明顯增高,β-EP明顯降低,提示何首烏飲可有效調(diào)整中樞神經(jīng)遞質(zhì)的合成,恢復(fù)下丘腦、海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡,改善了下丘腦及海馬神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的功能。因此說(shuō)明何首烏飲具有良好的延緩衰老的作用。

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