趙娟 廖崢嶸 呂品 張鳳云 雷宇華

小細胞肺癌是支氣管肺癌中較為特殊的一種類型，惡性程度在所有肺癌中最高，嚴重影響人類的生命健康。由于中藥不良反應(yīng)小，近年來在腫瘤臨床防治工作中備受關(guān)注并取得了一定成果［1］。山奈酚是植物界中廣泛存在的黃酮類化合物，主要來源于姜科植物山奈的根莖，具有抗癌［2］、抗炎［3］、抗氧化［4］等多種生物活性及藥理作用，其中抗腫瘤作用是一個研究熱點。但山奈酚對肺癌的抗腫瘤作用研究較少。本研究觀察了山奈酚對人小細胞肺癌H446細胞增殖抑制和誘導凋亡的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及設(shè)備 試劑山奈酚購自Sigma公司(批號:54608195，純度＞96%)，用 DMSO溶解配制成 100 mmol/L的

項目來源:河北省科技支撐計劃(編號:08206117D)，河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃指導項目(編號:08259)儲存液，分裝，避光于-20℃保存;人小細胞肺癌H446購自北京協(xié)和細胞庫;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;Bax抗體、bcl-2抗體購自美國Santa cruz公司;流式細胞儀FACSTAR Calibur，美國Becton Dickinson公司。

1.2 細胞培養(yǎng) H446細胞采用RPMI 1 640培養(yǎng)基(含有10%小牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/ml)。置于37℃，5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，待長滿瓶底80% ～90%后進行傳代實驗。

1.3 MTT法測細胞生長的抑制率 取對數(shù)生長期的細胞，以5×104個/ml細胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl，于37℃，5%CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為0、10、20、40、80 μmol/L 山奈酚，每種藥物濃度均做8 個復孔。在培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心10 min，棄去上清，每孔加二甲基亞楓150μl，震蕩10 min，用酶標儀測570 nm的A值。根據(jù)下列公式計算抑制率:抑制率=［(對照組A-實驗組A)/對照組A］×100%。

1.4 流式細胞儀分析凋亡率 細胞培養(yǎng)24 h后，加不同濃度山奈酚處理，設(shè) 0、10、20、40、80 μmol/L 共 4 個濃度組，作用24 h后，分別收集各組的細胞，每組3孔，碘化丙啶(PI)單染后上機檢測分析。

1.5 Western Blotting檢測bax、bcl-2蛋白的表達 終濃度為0、10、20、40、80 μmol/L 的山奈酚處理人小細胞肺癌 H446 細胞24 h后，提取細胞總蛋白。蛋白定量后采用SDS-PAGE電泳，將凝膠蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，TBS洗膜3次，加入5%奶粉封閉2 h。于1∶1 000的一抗4℃孵育過夜。TBS洗膜3次，1∶5 000稀釋的HRP標記的二抗室溫孵育1 h。TBS洗膜3次后加入ECL發(fā)光液顯色拍照。以β-actin為內(nèi)參，用BIO-RAD圖像分析軟件對條帶灰度值進行定量分析。

1.6統(tǒng)計學分析應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 山奈酚抑制H446細胞的增殖活性 山奈酚作用H446細胞24 h后，在20μmol/L及以上濃度組與對照組比較有顯著抑制作用，抑制率隨山奈酚濃度的升高而增大(P﹤0.01)。見表1。

表1 山奈酚對人小細胞肺癌H446細胞的抑制作用n=8，±s

表1 山奈酚對人小細胞肺癌H446細胞的抑制作用n=8，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

濃度(μmol/L) A值 抑制率對照組0.65±0.02 10 0.57±0.05 11.98±1.81 20 0.49±0.03* 25.46±2.57 40 0.41±0.04* 32.06±5.66 80 0.27±0.06#53.25±4.68

2.2 細胞凋亡率的檢測 藥物處理24 h后，在DNA直方圖上可見低于G1期DNA含量的凋亡峰，是凋亡細胞形成的亞二倍體峰，隨著山奈酚濃度增加，凋亡峰越來越明顯。對照組及10、20、40、80 μmol/L 處理組凋亡率分別為 5.06%、6.69%、11.23%、17.88%、21.95%，其中40、80μmol/L藥物處理組與對照組比較細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.3 Western Blotting檢測Bax、bcl-2蛋白的表達 隨山奈酚處理濃度增大bax蛋白表達上調(diào)，bcl-2蛋白則相反，即隨山奈酚處理濃度增大蛋白表達量下降。見表2、圖1。

3 討論

資料顯示山奈酚是植物界中廣泛存在的黃酮醇類化合物，具有抗炎、抗癌、抗氧化等多種生物活性，具有開發(fā)成為抗癌新藥的潛能。大量研究表明，山奈酚抗腫瘤與細胞凋亡密切相關(guān)［5］。

圖1 山奈酚對H446細胞bax蛋白(A)和bcl-2蛋白的影響(B)

表2 山奈酚對H446細胞bax蛋白和bcl-2蛋白的影響

研究表明，腫瘤的發(fā)生與細胞增殖分化以及異常凋亡有關(guān)，抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡是化療藥物的重要作用機制之一［6］。本實驗MTT結(jié)果表明山奈酚對人小細胞肺癌H446細胞增殖具有明顯的抑制作用，抑制率隨藥物濃度增加而增大。流式細胞儀檢測細胞死亡率表明，山奈酚有較強誘導人小細胞肺癌H446細胞凋亡的作用。參與細胞凋亡的基因眾多，其中bcl-2基因家族既能抑制又能促進細胞凋亡。Bax基因促進細胞凋亡，而bcl-2基因為長壽基因，沉默該基因可以抑制多種腫瘤細胞的生長增殖，是抑制細胞凋亡的主要基因［7］。研究表明大多腫瘤中均有bcl-2的高表達，如肝癌、肺癌、前列腺癌等，bcl-2基因若高表達則抑制腫瘤細胞凋亡，而沉默該基因則抑制腫瘤細胞生長。Bax基因不但拮抗bcl-2的抑制凋亡作用，而且有直接促進細胞凋亡的功能［8，9］。本實驗結(jié)果顯示，山奈酚處理后，Bax蛋白表達上調(diào)，bcl-2蛋白表達下調(diào)。因此，我們推測Bax蛋白和bcl-2蛋白表達變化，參與了山奈酚誘導的人小細胞肺癌H446細胞凋亡過程。

1 鄒亞峰，王國臣.化療對非小細胞肺癌患者血清抗Survivin抗體水平的臨床研究.河北醫(yī)藥，2010，32:11-13.

2 Garcia R，Gonzalez CA，Agudo A，et al.High intake of specific carotenoids and flavonoids does not reduce the risk of bladder cancer.Nutr Cancer，1999，35:212-214.

3 Jovanovic SV，Simic MG.Antioxidants in nutrition.Ann N Y Acad Sci，2000，899:326-334.

4 Lee EJ，Ji GE，Sung MK.Quercetin and kaempferol suppress immunoglobulin E-mediated allergic inflammation in RBL-2H3 and Caco-2 cells.Inflamm Res，2010，59:847-854.

5 Huang WW，Chiu YJ，F(xiàn)an MJ，et al.Kaempferol induced apoptosis via endoplasmic reticulum stress and mitochondria-dependent pathway in human osteosarcoma U-2 OS cells.Mol Nutr Food Res，2010，54:1585-1595.

6 張永亮.化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡和相關(guān)因子的調(diào)控.國外醫(yī)學遺傳學分冊，2002，25:121-126.

7 Lessene G，Peter E，Czabotar M，et al.BCL-2 family antagonists for cancer therapy.Nature Reviews Drug Discovery，2008，7:989-1000.

8 Karnak D，Xu L.Chemosensitization of prostate cancer by modulating Bcl-2 family proteins.Curr Drug Targets，2010，11:699-707.

9 Mullauer FB，Kessler JH，Medema JP.Betulinic acid，a natural compound with potent anticancer effects.Anticancer Drugs，2010，21:215-227.