馬超英 涂顯琴 牛順子 高雅蓉 唐靜 耿耘 蔣合眾

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它嚴(yán)重影響人類(lèi)生命健康，目前已成為世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。峨?yún)⑹莻阈慰贫雲(yún)僦参?，與峨蕊、雪磨芋歷來(lái)被人們認(rèn)為是峨眉山的三大特產(chǎn)而聞名遠(yuǎn)近。中醫(yī)認(rèn)為峨?yún)⒂薪∑⒁鏆?，活血化瘀的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道從峨?yún)⒏刑崛〕鲆环N具有抗腫瘤活性的有效成分，結(jié)構(gòu)研究表明是去氧鬼臼毒素(峨?yún)?nèi)酯)，對(duì)人體子宮頸腺癌傳代細(xì)胞系的作用具有生物活性［1］，

而對(duì)肺癌的作用筆者尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文主要研究峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?duì)肺癌細(xì)A549和H460增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株A549和H460購(gòu)自于四川大學(xué)華西國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥品與試劑 RPMI-1640和胰蛋白酶均采用Gibco進(jìn)口分裝，MTT購(gòu)自寶信生物有限公司。峨?yún)嬈?gòu)自于四川省峨眉山市仙山中藥飲片公司，經(jīng)本院宋良科副教授鑒定為四川峨眉山產(chǎn)傘形科峨?yún)僦参锒雲(yún)⒌母稍飰K根。其余試劑均采用分析純。

1.3 主要儀器 CO2恒溫孵箱(3110型，美國(guó)Thermo公司)、細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶(美國(guó)Coster公司)、酶標(biāo)儀(Elx-800型，美國(guó)Bio-Tek公司)、離心機(jī)(L420型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司)、倒置相差顯微鏡(日本索尼公司)、熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、超凈工作臺(tái)(BSW-880，江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司)、閃式提取器(JHBE-50型，河南金鼎科技有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 峨?yún)⑹兔烟崛∥锏闹苽?將峨?yún)⑶袛?，粉碎成?xì)小顆粒，過(guò)20目篩，烘干，用8倍量80%乙醇浸泡24 h，利用閃式提取器，分別間斷提取共3 min(15 000 r/min，1 800 W)，抽濾，得到濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到浸膏。再用石油醚萃取，得石油醚提取物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得浸膏，使用前用RPMI-1640調(diào)整至實(shí)驗(yàn)所需濃度，DMSO(濃度＜0.05%)助溶。

1.4.2 細(xì)胞株培養(yǎng):將肺癌細(xì)胞A549和H460接種于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2天換液傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?duì)肺癌細(xì)胞A549、H460增殖抑制作用的檢測(cè):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，2× 104個(gè)·ml-1·孔-1。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的峨?yún)⑹兔烟崛∥铮苍O(shè)7個(gè)藥物濃度梯度，分別為1.25、2.5、5、10、20、40和80 μg/ml，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔體積500 μl，培養(yǎng)48 h后，每孔加入1 mg/ml MTT工作液500 μl，37℃放置4 h，棄上清，每孔加入500 μl 0.4%酸化異丙醇，220 r/min搖床震蕩5 min溶解結(jié)晶，經(jīng)充分震蕩后，吸取200 μl至96孔酶標(biāo)板于全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的各孔吸光度(OD值)，0.1%DMSO作為陰性對(duì)照，根據(jù)0.1%DMSO值繪制曲線，比較不同濃度峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?duì)2個(gè)細(xì)胞株增殖的影響［2］。

1.4.4 DAPI染色:將潔凈無(wú)菌蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，使為60%～80%。設(shè)對(duì)照組、2.5 μg/ml、5 μg/ml峨?yún)⑹兔烟崛∥锝M(A549)和對(duì)照組、1.25 μg/ml、2.5 μg/ml峨?yún)⑹兔烟崛∥锝M(H460)，分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄廢液，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片35 min，1×PBS沖洗3次，每次2 min，加入2 μl DAPI染色液，染色15 min，1×PBS沖洗2次，取出爬片用封片液封片，熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)在350 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)在460 nm左右。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?duì)肺癌細(xì)胞A549和H460增殖的抑制作用 結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞存活率不斷下降，峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?duì)肺癌細(xì)胞H460的抑制作用比對(duì)細(xì)胞A549明顯。經(jīng)計(jì)算得出，峨?yún)⑹兔巡课惶崛∥飳?duì)肺癌細(xì)胞A549和H460的IC50值分別為6.13 μg/ml和0.97 μg/ml，見(jiàn)圖1。

2.2 峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?duì)肺癌細(xì)胞A549和H460凋亡的影響倒置顯微鏡觀察到，經(jīng)峨?yún)⑹兔烟崛∥锾幚?8 h后，肺癌細(xì)胞A549和H460的生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周?chē)募?xì)胞脫離，細(xì)胞由梭形變成圓形細(xì)胞脫落，浮懸于培養(yǎng)液中［3］。熒光顯微鏡觀察到，經(jīng)峨?yún)⑹兔烟崛∥锾幚?4 h后，肺癌細(xì)胞A549和H460生長(zhǎng)明顯受到抑制，熒光增加，有明顯的細(xì)胞核斷裂和皺縮，隨劑量增加，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越明顯，見(jiàn)圖2。

圖1 不同濃度峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?duì)肺癌細(xì)胞A549和H460生長(zhǎng)的抑制作用

圖2 峨?yún)⑹兔烟崛∥锾幚砗蠹?xì)胞形態(tài)(×400)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?duì)肺癌細(xì)胞A549和H460增殖的抑制作用，經(jīng)計(jì)算得出其IC50值分別為6.13 μg/ml和0.97 μg/ml，且抑制率與濃度呈明顯的效應(yīng)關(guān)系，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率不斷下降。用倒置顯微鏡觀察到，經(jīng)峨?yún)⑹兔烟崛∥锾幚矸伟┘?xì)胞A549和H460后，癌細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周?chē)募?xì)胞脫離，細(xì)胞由梭形變成圓形細(xì)胞脫落，浮懸于培養(yǎng)液中。不同濃度的峨?yún)⑹兔烟崛∥镒饔糜贏549和H460細(xì)胞，24 h后用DAPI染色，熒光下可見(jiàn)細(xì)胞核發(fā)生明顯皺縮和斷裂。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)峨?yún)⑹兔烟崛∥飳?duì)肺癌細(xì)胞A549和H460的影響，為峨?yún)⒖鼓[瘤的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其抗腫瘤機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

1 Yong Y，Shin SY，Y Lee YH，et al.Antitumor activity of deoxypodophyllotoxin isolated from Anthriscus sylvestris:Induction of G2/M cell cycle arrest and caspase-dependent apoptosis.Bioorg Med Chem lett，2009，19: 4367-4371.

2 鐘華，尹蓉莉，謝秀瓊，等.不同莪術(shù)提取物對(duì)小鼠皮膚癌的藥效研究.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21:2566-2567.

3 王維民，劉延慶，戴小軍.南蛇藤提取物誘導(dǎo) SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2010，23:154-156.