喻昌利 李林 戈艷蕾 王紅陽(yáng)

羅格列酮對(duì)大鼠肺纖維化細(xì)胞模型干預(yù)治療的療效觀察

喻昌利 李林 戈艷蕾 王紅陽(yáng)

目的采用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細(xì)胞，給予羅格列酮干預(yù)，明確其對(duì)大鼠肺纖維化的影響。方法 以組織貼塊法培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞，分為0.4%血清對(duì)照組(空白對(duì)照組)、TGF-β1模型組(模型組)、TGF-β1+不同濃度羅格列酮干預(yù)組(干預(yù)組)，分別檢測(cè)大鼠肺纖維化細(xì)胞代謝活性及Ⅰ、Ⅲ型膠原合成情況。結(jié)果 不同濃度羅格列酮干預(yù)組OD值與模型組比較都有所下降(P＜0.05)，其中羅格列酮濃度在10 μmol/L時(shí)OD值與模型組比較下降最為明顯，不同羅格列酮濃度組間OD值差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。10 μmol/L羅格列酮干預(yù)組與模型組相比較，Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)下降，差異具有顯著性(P＜0.05)。結(jié)論 羅格列酮可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖和Ⅰ型、Ⅲ型膠原的合成。

肺纖維化;羅格列酮;過(guò)氧化物體增殖活化受體-γ;TGF-β1;大鼠;療效

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 出生1～2 d的Wistar大鼠(由河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)20只;小鼠抗大鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原單克隆抗體(Sigma產(chǎn)品);羊抗小鼠二抗、DAB顯色試劑盒(博士德生物有限公司);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)(peprotech產(chǎn)品);馬來(lái)酸羅格列酮(葛蘭素史克，購(gòu)自醫(yī)藥公司)。

1.2 方法 取出Wistar乳鼠肺組織，將肺組織剪碎成1 mm3大小，接種于培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)的細(xì)胞調(diào)整同步化后，使細(xì)胞靜止于G0/G1期，取第四代細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，分為3組:(1)空白對(duì)照組:以0.4%血清濃度DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)大鼠肺成纖維細(xì)胞。(2)模型組:0.4%血清培養(yǎng)條件下，給予TGF-β1(5 ng/ml)孵育細(xì)胞。(3)干預(yù)組:0.4%血清培養(yǎng)條件下，分別同時(shí)給予不同濃度羅格列酮(10、20、50、100 μmol/L)，預(yù)孵育30 min后給予TGF-β1(5 ng/ml)孵育細(xì)胞。按照以上實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)試劑，刺激48 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞代謝活性及免疫細(xì)胞化學(xué)常規(guī)染色方法檢測(cè)Ⅰ型與Ⅲ型膠原，經(jīng)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s

表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征 顯微鏡下觀察大鼠肺成纖維細(xì)胞呈梭形，胞質(zhì)透明，胞核較大，可見(jiàn)核仁。細(xì)胞伸出多個(gè)突起，并連接成網(wǎng)狀，在局部融合成片，細(xì)胞密集時(shí)呈放射狀分布，TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化細(xì)胞模型建立成功。

2.2 羅格列酮對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用 干預(yù)組隨著羅格列酮?jiǎng)┝?10、20、50、100 μmol/L)的增加，反映細(xì)胞代謝活性的OD值分別是模型組的80.6%，85.1%，87.2%，89.8%和94.9%，與模型組比較均有所下降，不同羅格列酮濃度組與模型組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中當(dāng)羅格列酮濃度在10 μmol/L時(shí)干預(yù)組OD值與模型組比較下降最為明顯，但不同羅格列酮濃度組間OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 羅格列酮對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖抑制的劑量關(guān)系

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定肺成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)情況 當(dāng)羅格列酮濃度在10 μmol/L時(shí)反映細(xì)胞代謝活性O(shè)D值與模型組比較下降最為明顯，選擇羅格列酮濃度10 μmol/L進(jìn)行干預(yù)，與模型組相比較，Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠肺纖維化細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)情況

3 討論

肺纖維化是在各種病因下導(dǎo)致的肺間質(zhì)纖維增生。有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以調(diào)控細(xì)胞的增生、分化、凋亡、黏附、運(yùn)動(dòng)以及產(chǎn)生某些促纖維化細(xì)胞因子［3］，是目前最強(qiáng)的促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的刺激因子，在肺纖維化疾病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4］。

目前肺間質(zhì)纖維化尚無(wú)有效藥物治療。研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ通過(guò)連接到目標(biāo)基因增強(qiáng)子序列上的過(guò)氧化物體增殖反應(yīng)元件，可以調(diào)節(jié)生殖、代謝、生長(zhǎng)和免疫反應(yīng)的基因表達(dá)［5，6］。有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)肺纖維化大鼠模型應(yīng)用PPARγ激動(dòng)劑治療，可以使肺纖維化緩解，提示PPARγ激動(dòng)劑對(duì)肺纖維存在一定治療作用［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)MTT法檢測(cè)干預(yù)組OD值較模型組降低，提示羅格列酮干預(yù)對(duì)大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖有抑制作用，其中當(dāng)羅格列酮濃度在10 μmol/L時(shí)，干預(yù)組OD值與模型組比較下降最為明顯，但不同羅格列酮濃度組間OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。同時(shí)在檢測(cè)大鼠肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，予羅格列酮干預(yù)后，Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)量下降，顯示羅格列酮能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)，在一定程度上提示羅格列酮有拮抗肺纖維化的作用。表明羅格列酮對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖有抑制作用，這為肺間質(zhì)纖維化的防治提供了新的思路。

1 曹殿鳳，尚波.轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β1及其基因多態(tài)性在塵肺領(lǐng)域的研究進(jìn)展.中國(guó)工醫(yī)學(xué)雜志，2008，21:111-113.

2 Genovese T，Mazzon E，Di Paola R，et al.Role of endogenous and exogenous ligands for the peroxisome proliferator-activated re-ceptoralpha in the development of bleomycin-induced lung injury.Shock，2005，24:547-555.

3 Necela BM，Su W，Thompson EA.Toll-like receptor 4 mediates cross-talk between PPARγ and NF-kappaB in macrophages.Immunology，2008，125:344-358.

4 Reddy RC.Immunomodulatory role of PPARγ in alveolar macrophages.Investig Med，2008，562:522-527.

5 梁鳴，李雯，顧海峪.羅格列酮對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的影響.廣東醫(yī)學(xué)，2007，28:195-196.

6 Madtesdk A，Elstonal S，Hachmanrl J，et al.Transforming growth factoralpha deficiency reduced pulmonary fibrosis in transgenic mice.Am J Res pir Cell Mol Biol，1999，20:924-934.

7 李晶，李忠，莫寶慶.ERK5 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2005，2:288-291.

Therapeutic effect of rosiglitazone on the models of rat pulmonary fibrosis cell

YU Changli，LI Lin，GE Yanlei，et al．Department of Respiratory Medicine，Hebei United University，Hebei，Tangshan 063000，China

ObjectiveTo observe the therapeutic effect of rosiglitazone on the models of rat pulmonary fibrosis cell by inducing rat lung fibroblast with transforming growth factor(TGF-β1)，then giving rosiglitazone intervention therapy.MethodsThe lung fibroblasts were cultured with tissue paste-block method，which were divided into 0.4%serum control group(blank control group)，TGF-β1 model group(model group)，TGF-β1+different concentration rosiglitazone treatment groups(intervention group)，and immunohistochemical staining was used to detect the metabolic activity of pulmonary fibrosis cell and the synthesis condition of typeⅠ，Ⅲ collagen.ResultsCompared with the model group，different concentrations of rosiglitazone groups’OD values declined(P＜0.05)，and 10μmol/L rosiglitazone group had the most obvious result，different concentration of rosiglitazone was no significant difference in OD values(P ＞0.05).10 mol/L rosiglitazone group decreased typeⅠandⅢcollagen expression(P＜0.05).ConclusionRosiglitazone can inhibit the proliferation of rat lung fibroblast induced by TGF-β1 and can inhibit the synthesis of typeⅠ，Ⅲ collagen.

pulmonary fibrosis;rosiglitazone;PPAR-γ;TGF-β1;rats;effect近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ激動(dòng)劑——羅格列酮，可以通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及有關(guān)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的活化、增生及炎性反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，從而具有抗纖維化作用［1］。目前其抗纖維化作用的研究主要集中在肝臟、心臟和腎間質(zhì)［2，3］，對(duì)抗肺間質(zhì)纖維化的研究較少。本實(shí)驗(yàn)探討羅格列酮對(duì)肺間質(zhì)是否存在抗纖維化作用，為肺間質(zhì)纖維化的防治提供新思路。

R 563

A

1002-7386(2011)09-1299-02

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．006

063000 河北省唐山市，河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科

2011-01-06)

·論著·