趙玉梅，張金嶺，王守峰

(1.山東大學(xué)附屬臨沂市人民醫(yī)院腫瘤二科，山東臨沂276000; 2.山東大學(xué)附屬臨沂市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東臨沂276000)

NK細(xì)胞比例增高的初治肝癌患者群體存在價(jià)值分析

趙玉梅1，2，張金嶺1，王守峰1

(1.山東大學(xué)附屬臨沂市人民醫(yī)院腫瘤二科，山東臨沂276000; 2.山東大學(xué)附屬臨沂市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東臨沂276000)

目的 探討NK細(xì)胞比例增高的初治肝癌患者群體存在的意義。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)分析初次治療的45例肝癌患者NK細(xì)胞和CD4+T/CD8+T的比例。結(jié)果 45例中38例NK細(xì)胞比例(5.72%)和CD4+T/CD8+T的比例(0.60)顯著低于正常人水平(13.18%和0.70)，7例NK細(xì)胞比例(28.78%)和CD4+T/CD8+T的比例(2.00)顯著高于正常人水平(P＜0.05)。結(jié)論 NK細(xì)胞比例增高的初治肝癌患者群體是確實(shí)存在的，其原因可能是處于疾病的早期，免疫系統(tǒng)正處于清除腫瘤細(xì)胞階段。

肝癌;NK細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)

NK細(xì)胞構(gòu)成了機(jī)體抗腫瘤的第一道防線，其活性與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系極大。肝癌患者外周血NK細(xì)胞的比例報(bào)道不一，多數(shù)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示肝癌患者NK細(xì)胞的比例低于正常人群［1］，但是在我們臨床工作中發(fā)現(xiàn)，少數(shù)初次治療的肝癌患者NK細(xì)胞比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出正常界限，并且這些肝癌患者在治療過程中有相對(duì)較好的療效，作者應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了45例肝癌患者的NK細(xì)胞比例和CD4+T/CD8+T的比例，探討NK細(xì)胞比例增高的肝癌患者群體存在的依據(jù)以及在肝癌診治中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2008年11月至2009年3月經(jīng)肝穿刺細(xì)胞學(xué)檢查確診為肝癌的初次住院患者45例(肝癌組)，健康體檢者30例(對(duì)照組)。肝癌組45例，男性26例，女性19例;年齡39～70歲，中位年齡55歲;均無明顯癥狀和典型體征。對(duì)照組30例:男性16例，女性14例;年齡42～67歲，中位年齡52歲;無癥狀和體征，肝功能正常。

1.2 主要儀器和試劑 鼠抗人CD34-PECY5/CD3-FITC/CD56-PE三色標(biāo)記、CD3-PE/CD4-FITC/CD8-PECY5三色標(biāo)記和同型對(duì)照鼠抗人IgG1-PC5/IgG1-FITC/IgG-PE均購自法國Immunotech公司，EPICSXL型流式細(xì)胞儀為美國Beckman-Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 方法 抽取靜脈血1 mL于EDTA-K3抗凝管中，充分搖勻 。在測(cè)定管中加入 CD34-PECY5/CD3-FITC/CD56-PE和 CD3-PE/CD4-FITC/CD8-PECY5各20 μL，待測(cè)全血標(biāo)本100 μL，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度1×106L－1。對(duì)照管中加入鼠抗人 IgG1-ECY5/IgG1-FITC/ IgG1-PE 20 μL，設(shè)鼠抗人同型對(duì)照，混勻后室溫避光反應(yīng)20 min，以Q-Prep儀溶血后，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 檢測(cè) FCM激光為冷亞激光，波長(zhǎng)488 nm，采用flow-check調(diào)整光路，用同型對(duì)照調(diào)電壓，以SSC橫座標(biāo)，F(xiàn)SC為縱座標(biāo)，構(gòu)建散點(diǎn)圖，在散點(diǎn)圖上采用設(shè)門技術(shù)分析標(biāo)本中NK細(xì)胞比例及CD4+T/CD8+T的比例。每份標(biāo)本計(jì)數(shù)2×104個(gè)細(xì)胞。

1.5 結(jié)果判定 正常NK細(xì)胞比例的范圍為4.80%～10.10%，其比例超過10.10%為增高，大于20.20%為明顯增高;其比例低于4.80%為減低。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組與正常對(duì)照組的NK細(xì)胞百分率比較肝癌組A代表高NK細(xì)胞組，肝癌組B代表低NK細(xì)胞組;對(duì)照組為健康體檢者。肝癌組A與肝癌組B和對(duì)照組的NK細(xì)胞水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 肝癌組與對(duì)照組NK細(xì)胞比較

2.2 肝癌組與對(duì)照組外周血中NK細(xì)胞百分率檢測(cè)的結(jié)果 橫坐標(biāo)為CD3陰性的細(xì)胞亞群，縱坐標(biāo)為CD56陽性的細(xì)胞亞群，CD3陰性、同時(shí)CD56陽性的細(xì)胞亞群為NK細(xì)胞亞群，見圖1。

圖1 肝癌組與對(duì)照組外周血中NK細(xì)胞百分率的檢測(cè)

3 討論

NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要的作用［1］。但是在腫瘤免疫中，患者往往存在著低免疫狀態(tài)。其可能的機(jī)制:腫瘤細(xì)胞不但可以直接或者通過分泌可溶性配體的形式間接引起NK細(xì)胞表面活化性受體的下調(diào)，進(jìn)而影響NK細(xì)胞的活化程度［2－5］。肝癌患者體內(nèi)NK細(xì)胞的表達(dá)水平是正常偏低或者低于正常的［6］。但是在我們的臨床研究中發(fā)現(xiàn)了肝癌A組患者NK細(xì)胞的表達(dá)水平是明顯高于正常的，達(dá)到近30%左右，并且排除了實(shí)驗(yàn)技術(shù)誤差。在臨床療效觀察中肝癌A組患者治療過程中整體療效和生存時(shí)間均好于或長(zhǎng)于肝癌B組患者。而且在肝癌A組患者中，接受化療和介入治療后有不同的療效(接受介入治療4例，接受化療3例)，其中接受介入治療的患者療效相對(duì)更好。并且相對(duì)于接受化療治療患者，接受介入治療的患者NK細(xì)胞的水平治療前后一直明顯高于正常，少數(shù)初治肝癌患者NK細(xì)胞的表達(dá)水平高于正常，這一少見群體是客觀存在的。

用腫瘤免疫編輯學(xué)說來解釋此現(xiàn)象［7－8］:該學(xué)說認(rèn)為在腫瘤的發(fā)展過程中，機(jī)體免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞之間存在著相互影響:免疫系統(tǒng)重塑了腫瘤細(xì)胞的免疫原性，腫瘤細(xì)胞則影響了免疫系統(tǒng)的功能。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程中免疫系統(tǒng)發(fā)揮著雙重作用:不斷的消滅腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也在和腫瘤細(xì)胞作斗爭(zhēng)的過程中篩選出了低免疫原性腫瘤細(xì)胞亞克隆，使其成為腫瘤進(jìn)展的根源。該學(xué)說將免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用分為3個(gè)階段［9］:免疫系統(tǒng)清除腫瘤細(xì)胞階段、雙方對(duì)峙階段、腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)攻擊階段。應(yīng)用腫瘤免疫編輯學(xué)說來分析我們監(jiān)測(cè)到的高NK比例肝癌患者群體，也許此時(shí)患者的免疫系統(tǒng)正處于清除腫瘤細(xì)胞階段。因?yàn)槲覀冇^測(cè)到伴隨高NK細(xì)胞比例的初治肝癌患者CD4+T/CD8+T比例也較高，CD4細(xì)胞亞群為抗原提呈T細(xì)胞為主體的淋巴細(xì)胞亞群，CD8細(xì)胞亞群為細(xì)胞毒性T細(xì)胞為主體的淋巴細(xì)胞亞群，兩者比例升高提示免疫系統(tǒng)有較活躍的增殖和分化活性，CD4+T/CD8+T比例增高從側(cè)面提示了免疫系統(tǒng)可能正處于清除腫瘤細(xì)胞階段［9－10］。

從臨床療效方面我們也觀測(cè)到伴隨高NK細(xì)胞比例的初治肝癌患者整體生存周期較長(zhǎng)、黃疸和腹水出現(xiàn)時(shí)間較晚、接受介入治療的療效好于接受化療的療效等現(xiàn)象，證實(shí)NK細(xì)胞比例增高的初治肝癌患者群體是確實(shí)存在的，提示我們采用新的視角和觀點(diǎn)來看待這群相對(duì)特殊的肝癌患者診療方案的選擇和增加對(duì)腫瘤與免疫系統(tǒng)關(guān)系的理解，為提高肝癌患者治療療效和延長(zhǎng)肝癌患者生存時(shí)間提供幫助。

［1］ Kim R，Emi M，Tanabe K.Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape［J］.Immunology，2007，121(1):1－14.

［2］ Maccalli C，Scaramuzza S，Parmiani G.TNK cells(NKG2D+CD8+or CD4+T lymphocytes)in the control of human tumors［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(5):801－808.

［3］ Kim J，Chang CK，Hayden T，et al.The activating immunoreceptor NKG2D and its ligands are involved in allograft transplant rejection［J］.J Immunol，2007，179(10):6416－6420.

［4］ Yoon SR，Chung JW，Choi I.Development of natural killer cells from hematopoietic stem cells［J］.Mol Cells，2007，24(1):1－8.

［5］ Coudert JD，Zimmer J，Tomasello E，et al.Altered NKG2D function in NK cells induced by chronic exposure to NKG2D ligand-expressing tumor cells［J］.Blood，2005，106(5):1711－1717.

［6］ 湯釗猷，余業(yè)勒.原發(fā)性肝癌［M］.2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:182－185.

［7］ Dunn GP，Koebel CM，Schreiber RD.Interferons，immunity and cancer immunoediting［J］.Nat Rev Immunol，2006，6(11):836－848.

［8］ Schreiber RD.Cancer vaccines 2004 opening address:the molecular and cellular basis of cancer immunosurveillance and immunoediting［J］.Cancer Immun，2005，5 Suppl 1:1.

［9］ Powell JD，Delgoffe GM.The mammalian target of rapamycin:linking T cell differentiation，function，and metabolism［J］.Immunity，2010，33(3):301－311.

［10］ Louafi S，Boige V，Ducreux M，et al.Gemcitabine plus oxaliplatin (GEMOX)in patients with advanced hepatocellular carcinoma (HCC):results of a phase II study［J］.Cancer，2007，109(7):1384－1390.

R735.7

B

1673－5412(2011)03－0242－02

趙玉梅(1963－)，女，主管藥師，主要從事腫瘤藥學(xué)研究。

張金嶺(1980－)，男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤細(xì)胞免疫學(xué)研究。E-mail:jl_zhang@yahoo.cn

2011－03－21)