葛麗麗 綜述;楊小昂 審校

(鄭州大學河南省醫(yī)藥科學研究院，河南鄭州450052)

肝癌干細胞的研究進展

葛麗麗 綜述;楊小昂 審校

(鄭州大學河南省醫(yī)藥科學研究院，河南鄭州450052)

肝癌;干細胞;標志物

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，主要分布于亞洲東南部和撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)，近25年，美國和歐洲地區(qū)發(fā)病率也在持續(xù)增加。肝癌的死亡率僅次于肺癌和結腸癌排名世界第三。預計未來20年，其發(fā)病率和死亡率還會成倍上升［1－2］。然而目前肝癌的發(fā)病機制仍不明確，尋找其有效靶點，探明發(fā)病機制迫在眉睫。隨著研究的深入，在越來越多的腫瘤中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)的存在［3－5］，以此推測在肝癌中可能也存在肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSCs)。本文對近年來的肝癌干細胞研究的最新進展作一綜述。

1 腫瘤干細胞學說

腫瘤干細胞學說最先由Hamburger和Salmon提出，該學說認為:腫瘤的形成和發(fā)展是由一小群具有自我更新和分化潛能的細胞主導的過程，這類細胞在啟動腫瘤形成和生長過程中起著決定性作用，是腫瘤生長、轉移和復發(fā)的根源。他們通過軟瓊脂集落形成等一系列實驗證實這一學說［3－4］。Passegué等［5］證明了AML細胞中只有0.2%～1.0%的細胞亞群有持續(xù)的克隆形成能力，并分離出這些Thy－、CD34+、CD38－細胞，再移植入NOD/SCID小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)它們是惟一能在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成移植瘤的細胞，從而證明了這些細胞就是腫瘤干細胞。Reya等［6］通過對血液系統(tǒng)腫瘤的研究提出了系統(tǒng)的CSCs學說，并認為CSCs不僅存在于血液系統(tǒng)腫瘤，還存在于其他實體瘤中。目前，已有研究表明:在白血病、乳腺癌、人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、肺癌、結腸癌、甲狀腺癌和卵巢癌等實體瘤中相應的CSCs存在的可能性［7－12］。CSCs除具有自我更新和多向分化能力等正常干細胞的基本特性外，還具有腫瘤細胞的特性，能夠維持腫瘤的增殖和生長，逃避內(nèi)源性及外源性調控自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機制，并通過各種信號轉導和調節(jié)通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和復發(fā)［13］。

2 肝癌干細胞的來源

目前，關于肝癌干細胞的來源有兩種觀點:1)肝癌干細胞起源于成熟肝細胞的去分化［14］;2)起源于肝干細胞的成熟受阻。根據(jù)CSCs學說，肝癌干細胞可能來自于肝干細胞的突變。近些年來，隨著對于肝干細胞在肝癌形成過程中重要性的深入認識，越來越多的實驗證明肝癌干細胞起源于肝干細胞［15－18］。肝干細胞的來源有兩種可能，1)肝內(nèi)來源即在肝臟發(fā)育成熟后，組織內(nèi)仍保留少量處于休眠狀態(tài)的干細胞;2)肝外來源即肝干細胞來源于其他組織，例如骨髓等。

Grozdanov等［15］將癌胚蛋白Gpc3可以作為肝祖細胞的標志物，并通過建立Solt-Farber肝臟致癌模型研究證實肝祖細胞/卵圓細胞與肝癌的發(fā)生有密切的關系。卵圓細胞是一類胞核呈卵圓形的小上皮細胞，是肝內(nèi)膽管系統(tǒng)源性多潛能分化細胞群，既可向膽管細胞分化，又可向肝細胞分化，主要位于胚胎肝臟或成年肝臟的膽管末端Hering管。當肝臟損傷時，卵圓細胞能大量增殖，并遷移至肝臟實質，分化為肝細胞和膽管細胞，修復和重建肝臟。Dumble等［16］對敲除p53基因小鼠喂缺乏膽堿而補充乙硫氨酪酸的飲食，誘導卵圓細胞大量增生，分離卵圓細胞進行培養(yǎng)，將有永生化特性的細胞接種入NOD/SCID小鼠皮下長出與肝細胞癌相似的腫瘤，確定其由卵圓細胞分化而來，說明卵圓細胞可能參與肝癌的形成。

普遍認為肝干細胞主要存在于膽管末端Hering管中，但Oliva等［17］通過免疫組化和RNA-FISH技術發(fā)現(xiàn)肝癌組織中有肝干細胞的存在。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞與肝干細胞表達共同的表面標志物，也提示肝細胞癌可能起源于肝干細胞［18－19］。最近研究在肝癌組織中的具有干細胞特征的EpCAM(+)細胞引導了肝癌細胞的生長和轉移，進一步提示肝干細胞與肝癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系［20］。

3 肝癌干細胞表面標志物

肝干細胞可能為肝癌干細胞的來源，因此肝干細胞表達的某些表面標志物可能成為肝癌干細胞篩選的參考標志物。近年來，研究者從肝癌組織和細胞系中發(fā)現(xiàn)了CK7、CKI9、AFP、c-kit、OV6、Thy-1(CD90)、CD34等多種肝干細胞標志物。

CD133對于肝癌干細胞的研究具有一定的價值。據(jù)報道，在人肝癌細胞系中，CD133+細胞存在的比率是0%～65%，并具有高度增殖分化潛能和體內(nèi)成瘤能力及干細胞樣特性［21－23］。Suetsugu等［22］檢測3個肝癌細胞系中僅Huh-7細胞亞群表達CD133，且僅有CD133陽性細胞具有更強的增殖、分化和成瘤能力。同樣，Chiba等［23］研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞系Huh-7細胞中具有表達CD133的干細胞，并且CD133+細胞具有更高的增殖潛能和體外分化能力。將CD133+細胞純化后，與CD133－細胞同時接種于裸鼠背部皮下，觀察比較兩者的成瘤能力，結果顯示:CD133+細胞僅需1× 103個細胞即可在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，證明CD133+細胞具有更高的成瘤性。Sasaki等［24］對136個肝癌標本通過免疫組化分析和統(tǒng)計學方法評估CD133表達和臨床病理學之間的關系，發(fā)現(xiàn)CD133的表達與肝癌患者的生存率及預后密切相關。最近，Kohga等［25］又通過金屬蛋白酶的研究進一步證實了CD133+細胞在肝癌中的惡性潛能和特性。

CD90是一種相對分子質量25 000～37 000的糖蛋白，主要在白血病、骨髓間充質、乳腺癌、肝干/祖細胞細胞中表達［26－27］。Yang等［28］通過肝癌細胞系、肝癌組織和肝癌患者血樣的研究，發(fā)現(xiàn)所有的肝癌標本和91.6%的肝癌患者血樣中都有CD90+CD45－細胞群，將其分離出來接種到裸鼠和SCID/Beige小鼠體內(nèi)能很好的成瘤，還通過小鼠實驗證明了CD90+CD44+比CD90+CD44－具有更強的侵襲力，并與肝癌的原處和遠處轉移有密切關系。

最近，Haraguchi等［29］通過研究發(fā)現(xiàn)，CD13是肝癌干細胞系中處于半靜止狀態(tài)的一種標志物，主要存在于細胞周期的G0期，在腫瘤的中心形成細胞簇。通過藥物實驗證實了在鼠異種移植物模型中，CD13抑制劑能夠有效的抑制腫瘤的自我更新和形成靜止期腫瘤干細胞。由于腫瘤干細胞通常處于靜止期，細胞周期循環(huán)較慢，而臨床上使用的抗癌藥大多是針對處于活躍期的腫瘤細胞起作用，從而導致肝癌對放化療不敏感。故認為 CD13是肝癌干細胞的一種候選標志物。

EpCAM是最近發(fā)現(xiàn)的又一種新的標志物，Terris等［30］對235個肝癌標本進行基因圖譜和免疫組化分析，并通過流式分選儀分選出EpCAM+細胞，發(fā)現(xiàn)Ep-CAM+具有干細胞樣特性，且在免疫缺陷小鼠體內(nèi)能夠形成高度侵襲性的腫瘤;Wnt/beta聯(lián)蛋白的活化可以強化EpCAM+細胞的能力，而RNA干擾則可抑制EpCAM+細胞，從而得出結論，肝癌的生長和侵襲性與EpCAM+細胞密切相關。從肝癌組織和細胞中分析出其所占的比例最高可達99.2%，且2×102個細胞即可在裸鼠體內(nèi)成瘤，相對于其他標志物有更高的成瘤性［20］。

4 SP細胞與肝癌干細胞

側群(side pulation，SP)細胞分選方法已被廣泛應用于分選和鑒定腫瘤干細胞。SP細胞的發(fā)現(xiàn)為腫瘤干細胞的鑒別和分離提供了一種新的手段。該方法借助于SP細胞能排出Hoechst 33342染料這一特性，Hoechst 33342染料的排出依賴細胞膜上的一種ATP結合蛋白(ABCG2)運載體。

SP細胞也已應用于肝癌干細胞的鑒別。研究發(fā)現(xiàn)肝細胞癌組織中存在側群細胞，其具有干細胞樣特性。SP細胞雖不等同于肝癌干細胞，但SP細胞至少組成了肝癌干細胞的一部分。Shi等［31］研究表明，肝癌標本中存在SP細胞的比例與肝癌術后早期轉移復發(fā)有關。Chiba等［32］在肝癌細胞系 Huh7及 PLC/ PRE/5均分離出 SP細胞，比例分別是 0.25%和0.80%，進一步分析了分離出的SP細胞的特性，發(fā)現(xiàn)他們具有更強的增殖能力和抗凋亡特性。SP細胞還具有自我更新和多向分化潛能，分離的SP細胞體外培養(yǎng)能產(chǎn)生SP細胞和非SP細胞。肝癌細胞系Huh-7及PLC/PRE/5中分離的SP細胞還具有高成瘤性，皮下注射1×103個SP細胞可以使NOD/SCID小鼠皮下成瘤，而注射1×106個非SP細胞仍不能成瘤。

但SP方法也不是一個完美的鑒別肝癌干細胞的方法，該方法也有局限性，主要原因是染料 Hoechst 33342具有DNA毒性，分選后的細胞生物學特性是否發(fā)生改變存有疑問［1］。

總之，目前尚未發(fā)現(xiàn)肝癌的特異性的表面標志物，但越來越多的研究證明了肝癌干細胞的存在。尋找肝癌干細胞的高度特異性標記物將會進一步揭示肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移機制，為研究肝癌新的治療方法提供理論依據(jù)。

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R735.7

A

1673－5412(2011)03－0267－03

河南省基礎與前沿計劃(編號:072300450060);河南省醫(yī)學科技攻關計劃(編號:200703087)

葛麗麗(1981－)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫學研究。E-mail:geli.929@163.com

楊小昂(1963－)，男，博士，研究員，主要從事腫瘤免疫學研究。E-mail:xiaoangyang@163.com

2010－12－29)