沈晴昳

人牙髓細胞體外培養(yǎng)體是研究人牙髓細胞特性、牙髓組織活動及牙髓修復機制的主要體外模型。但由于人牙髓組織量少，細胞活性低,原代培養(yǎng)成功率較低。因此，筆者通過優(yōu)化人牙髓細胞的體外培養(yǎng)方法和條件，以期提高人牙髓細胞原代培養(yǎng)的成功率，為進一步研究人牙髓細胞的生物學特性提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2008年1月—3月于我院就診的患者28例，年齡12～20歲，平均14歲，因正畸減數或阻生需要拔除的健康、完整的雙尖牙共45顆，均經患者本人及家屬知情同意。牙齒拔除后使用無菌高速渦輪機金剛砂車針沿牙骨質-牙本質界進行環(huán)形切割，移至超凈臺內，PBS液反復沖洗后劈開冠根，輕柔取出牙髓組織，去除根尖孔端約2 mm部分，置D-Hanks液中備用。

1.2 主要儀器與試劑 CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱（Heraeus,德國），超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），倒置相差顯微鏡（Leica,德國）;Axioshop-Plus攝影顯微鏡（ZEISS,德國）,Z2型細胞計數儀（Beckman Coulter,美國），培養(yǎng)瓶（25 cm2）、培養(yǎng)皿（直徑6 mm，21 cm2）、24孔細胞培養(yǎng)板（Cornning,美國）、蓋玻片（海門昌隆儀器有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（Gibco，美國）、Ⅰ型膠原酶/Dispase（Sigma，美國）、即用型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德）。

1.3 方法

1.3.1 原代細胞的培養(yǎng) 采用3種不同培養(yǎng)方法，每種各15例。（1）組織塊法：在超凈臺內將人牙髓組織置于小平皿內，在含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基浸潤下充分剪碎，呈約0.5～1.0 mm3大小，用牙科探針將組織碎塊移入培養(yǎng)瓶內，以0.5 cm間距均勻擺置。培養(yǎng)瓶中加入少量含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，瓶底向上，放入37℃、5%CO2的飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中，3.5 h后翻轉培養(yǎng)。（2）酶消化法：將人牙髓組織在完全培養(yǎng)液浸潤下剪碎，呈約0.5～1.0 mm3大小，以3 g/L的I型膠原酶和4 g/L的dis?pase等量混合(體積比為1∶1)為消化液，用量為組織量的30～50倍，取約5 mL于37℃水浴搖床溫和振蕩，消化1 h，終止消化后1 200 r/min離心10 min，收集細胞并用培養(yǎng)液清洗2次，加入含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，轉置塑料培養(yǎng)瓶內37℃恒溫培養(yǎng)箱標準條件下培養(yǎng)。（3）改良組織塊法：在完全培養(yǎng)液充分浸潤條件下用眼科剪將牙髓組織剪成約0.5～1.0 mm3大小的組織塊。在直徑6 mm的培養(yǎng)皿的底壁滴加1滴含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，用牙科探針將組織碎塊移入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液滴中，使每滴培養(yǎng)液內約含8～10小塊組織。用少量無菌凡士林涂抹于消毒后的蓋玻片邊緣后，將蓋玻片緩慢覆蓋于組織塊上，輕輕加壓，通過凡士林將蓋玻片黏附在培養(yǎng)皿底壁，以固定組織塊。覆蓋時應注意使培養(yǎng)液完全充盈于蓋玻片與組織塊之間，切勿產生氣泡，加入含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液放入培養(yǎng)箱中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3.2 傳代方法 在倒置顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)方法的組織塊貼壁和細胞生長狀況。組織塊法和改良組織塊法培養(yǎng)時，在組織塊內未游出細胞前每7 d更換1次培養(yǎng)液，細胞游出后則3 d換液1次。待細胞單層生長到覆蓋瓶底的50%～60%以上時進行首次傳代，傳代比例為1∶1，以后傳代時機為細胞生長至鋪滿瓶底80%～90%，傳代比例為1∶2。酶消化法3 d換培養(yǎng)液，細胞生長至80%匯合態(tài)時，按1∶2消化傳代。

1.3.3 細胞來源鑒定及細胞生長曲線 分別取3種不同培養(yǎng)方法獲得的第2代對數生長期人牙髓細胞細胞爬片，按試劑盒說明書進行波形絲蛋白、角蛋白免疫組化染色，光鏡下觀察。取3種不同培養(yǎng)方法獲得的第3代人牙髓細胞，分別制成單細胞懸液，以2×104個細胞/孔接種于24孔板，每3 d換液1次，接種后每天消化5孔進行細胞計數，取平均值。連續(xù)計數9 d，繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 組織塊法原代細胞的生長狀況和形態(tài)學觀察 各例培養(yǎng)瓶中牙髓組織塊約1/3能緊密貼附于培養(yǎng)瓶壁。傳統(tǒng)組織塊法培養(yǎng)人牙髓細胞4例成功，成功率26.7%。成功的4例于8～15 d時細胞從組織塊邊緣游出，呈草叢狀生長，隨生長密度逐漸增加，細胞呈放射狀或漩渦狀排列，見圖1。細胞游出3～4周后覆蓋瓶底達60%～70%順利首次傳代，但細胞生長增殖較緩慢。傳代3～4次后生長周期趨于穩(wěn)定，平均每7 d傳代一次。獲得的牙髓細胞主要是成纖維樣細胞，形態(tài)多為長梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，核圓，核仁清晰，個別培養(yǎng)瓶中可見少量內皮樣細胞。有8例雖有個別組織塊邊緣有細胞游出，但因生長緩慢而無法成功傳代。其余3例，直至第28天仍未見組織塊內游出細胞。

2.2 酶消化法原代細胞的生長狀況和形態(tài)學觀察 酶消化牙髓組織后能獲得大量細胞，主要是成纖維樣細胞，偶見細長的梭形細胞和少量多角形內皮樣細胞團塊，能存活、貼壁的細胞只占少數，且細胞生長緩慢，見圖2。15例中僅有2例分別于12 d和14 d首次傳代，2例分別于第3天、第5天出現(xiàn)污染，其余11例細胞均達不到傳代要求，成功率13.3%。

2.3 改良組織塊法原代細胞生長狀況和形態(tài)學觀察 12例培養(yǎng)成功。培養(yǎng)皿中所有組織塊均被固定在底壁，未見懸浮的組織塊。15例牙髓組織中，有12例在3～10 d內可見細胞游出，其余3例在28 d內未見細胞游出，視為培養(yǎng)失敗，培養(yǎng)成功率80.0%。倒置相差顯微鏡下,細胞呈長梭形成纖維樣細胞形態(tài)，隨著培養(yǎng)時間的延長,幾乎所有的組織塊周圍都有細胞游出，且細胞密度明顯增加，肉眼觀察組織塊周邊可見明顯的生長暈，見圖3。細胞從組織塊中游出2～3周后，12例牙髓原代細胞均能成功傳代，傳代后第2天，懸浮的細胞又貼壁生長，呈條梭形，均勻地分布于整個培養(yǎng)皿底壁，牙髓細胞增殖活躍，見圖4。

2.4 細胞來源鑒定 3種不同方法獲得的細胞經免疫組化染色均顯示波形絲蛋白呈陽性，陽性顆粒在胞漿內分布均勻，角蛋白呈陰性，見圖5。

2.5 細胞生長曲線 3種不同培養(yǎng)方法獲得的人牙髓細胞均在接種后的第1天細胞數量有所下降，第2、3天細胞開始增殖，速度較緩慢，從第4天進入對數生長期，直至第8天進入平臺期，第9天細胞數量略有減少，生長曲線均呈“S”形，其中酶消化法較其他2種方法所得牙髓細胞的生長情況略差，見圖6。

圖6 不同原代培養(yǎng)方法所獲第3代人牙髓細胞的生長曲線

3 討論

牙髓組織是一種胚胎性、嬌嫩的疏松結締組織，含有成牙本質細胞、成纖維細胞、組織細胞和未分化間充質細胞等多種細胞成分。在一定程度范圍內遭受損傷、感染等不良刺激后，牙髓組織具有再生修復潛能。牙髓細胞培養(yǎng)是研究牙髓生物特性的主要模型和重要手段。但由于人牙髓組織量少，細胞活性低，且隨著年齡增長易發(fā)生退行性病變，所以牙髓組織比其他組織更難于進行原代培養(yǎng)［1-2］。

本實驗結果顯示，3種不同方法所獲取的細胞經免疫組化染色均顯示波形絲蛋白陽性、角蛋白陰性，提示細胞來源于外胚間葉組織，非上皮來源，符合牙髓組織學特征。

酶消化法是體外獲取細胞的常用方法之一。但有研究認為，經長時間或者高濃度酶消化作用后大量細胞被滅活，甚至可破壞細胞表面的蛋白質，使細胞表面通透性升高，活力下降，生長緩慢，難以成功傳代[3]。Gronthos等[4]首次將中性蛋白酶dispase與Ⅰ型膠原酶聯(lián)合應用消化人牙髓組織，獲得增殖力強、克隆形成率高并有分化潛能的具備干細胞特性的細胞群。但劉俊等[5]研究表明相對于其他組織而言，牙髓組織量太小，總體細胞量過少，Ⅰ型膠原酶在消化酶解人牙髓組織細胞外基質的主要成分Ⅰ型膠原的同時，對牙髓細胞也有毒性作用；中性蛋白酶dispase性質柔和，不會對細胞膜造成損害，與Ⅰ型膠原酶聯(lián)合應用后雖可減輕對細胞的毒性作用，但是必須保證足夠的消化時間才能使牙髓組織完全解離，而人牙髓組織代謝需求高，酶消化處理使其脫離營養(yǎng)環(huán)境過久同樣會造成大量細胞死亡。與組織塊法比較，單純酶消化法雖可獲得大量細胞，但由于酶對細胞的毒性作用，能存活壁的細胞數量卻極少，同時由于其操作繁瑣、易污染而較少采用,本研究中此法僅2例培養(yǎng)成功。

組織塊法操作簡單易行，已被廣泛應用于頜下腺[6]、嗅上皮[7]、主動脈平滑肌[8]等各種組織的原代培養(yǎng)中。影響組織塊貼壁的因素很多，包括組織塊本身的性狀、大小和干燥程度[9]。有報道組織塊法培養(yǎng)人牙髓細胞的成功率在10%左右，且失敗的主要原因是組織塊貼壁率較低[10]。在本研究中，筆者亦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶翻轉的時間很難掌握，過早翻轉，組織塊則因尚未牢固貼壁而易漂浮，如若翻轉過晚，組織塊因脫離營養(yǎng)環(huán)境過久，細胞不能游出，這些都可能導致細胞培養(yǎng)的失敗。

綜上，本研究對常規(guī)組織塊法進行的改良，使用蓋玻片覆蓋并固定牙髓組織塊，簡化了操作步驟，增加了組織塊與培養(yǎng)皿的接觸面積，更減少了翻轉加液及搬運過程中外力對貼壁組織塊的沖擊作用，解決了組織塊的貼壁難的問題，提高了培養(yǎng)的成功率。

（致謝：本實驗受到上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院的張秀麗老師、朱亞琴老師和江龍醫(yī)師的大力幫助，在此致以衷心的感謝）

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