陳武，吳茂材，吳敬源，楊健忠，陳振林，黃智慧，張?chǎng)斡浚むy

1 廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰人民醫(yī)院，十堰 442000

栓塞是導(dǎo)致心腦血管疾病死亡的重要原因之一，溶栓治療是一種有效的手段。目前臨床使用的主要溶栓藥物，如組織纖溶酶原激活劑 (Tissue-type plasminogen activator，t-PA)、尿激酶 (Urokinase-type plasminogen activator，UK)、鏈激酶 (Streptokinase，SK)，盡管表現(xiàn)出一定的治療效果，但由于需激活血液內(nèi)的纖溶酶原 (PLG) 為纖溶酶 (PLM) 后方能發(fā)揮溶栓作用，因此對(duì)陳舊性血栓的效率較低，導(dǎo)致治療窗短、出血并發(fā)癥較高，且不能阻止溶栓后再栓。近年來(lái)研究表明：由于PLM是血液內(nèi)發(fā)揮纖溶及栓溶作用的主要蛋白酶，與t-PA、UK、SK相比，PLM具有無(wú)免疫原性、可直接溶栓、出血并發(fā)癥低等特點(diǎn)[1-2]。但由于PLM的K區(qū)富含糖鏈、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且易自身降解，近年來(lái)通過大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)均未獲得高水平的活性蛋白[3-4]。

一些學(xué)者通過構(gòu)建小分子突變體，提高了表達(dá)水平，且保留了較好的纖溶活性，其中部分進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)研究[5-6]。我們前期工作構(gòu)建了人纖溶酶原K區(qū)缺失突變體 (hPLG-?K)，顯示出與 PLM相近的纖溶活性[7]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過突變激活環(huán)上的Pro559為Asp559，從而構(gòu)建出含有Arg-Gly-Asp (RGD) 三肽結(jié)構(gòu)的突變體 RGD-hPLG-?K，并通過酵母表達(dá)后，以期獲得一種具有直接溶栓作用和抗栓作用的重組人PLG。RGD序列可與纖維蛋白原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合與血小板聚集相關(guān)的膜受體GPIIb/IIIa，阻斷血栓形成的最后共同通路，其模擬物臨床上常用于預(yù)防再栓塞[8]。目前已構(gòu)建了多種包含RGD的融合蛋白，且顯示出較好的抗栓功能[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌 TOP10由本實(shí)驗(yàn)室保存，pDNRLIB-HPLG質(zhì)粒購(gòu)自南京恩晶生物科技有限公司，pPICZαA質(zhì)粒、巴斯德畢赤酵母GS115、Zeocin購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，牛血清PLG、PLM購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，pGM-T質(zhì)粒購(gòu)自上海Generay生物技術(shù)有限公司，XbaⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、T4 DNA連接酶、Premix Taq、DNA marker、蛋白marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，引物合成由上海生工生物工程公司提供，測(cè)序由深圳華大測(cè)序公司完成，質(zhì)粒抽提、DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，Ni-NTA親和介質(zhì)為北京瑞達(dá)恒輝公司產(chǎn)品；LBY-NJ血液凝聚儀購(gòu)自北京普利生公司，冷凍干燥儀ZMD-MS為Waters公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pPICZαA-RGD-HPLG-?K的構(gòu)建

HPLG-?K的亞克隆：以含全長(zhǎng)人PLG cDNA序列的 pDNR-LIB-HPLG質(zhì)粒作為模板，以上游引物F1和下游引物 D (表 1) 進(jìn)行 PCR。其中上游引物F1中引入 6×His，下游引物中加上 XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，40 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、測(cè)定濃度。

pGME-T-HPLG-?K的構(gòu)建：以HPLG-?K片段為模板，通過上游引物F2和下游引物D，其中上游引物F2中引入一個(gè)XhoⅠ酶切位點(diǎn)、KEX2酶識(shí)別位點(diǎn)序列，PCR條件同上。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、濃度測(cè)定后連接pGME-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，Amp-LB培養(yǎng)板篩選白斑，菌落PCR鑒定重組子。

表1 文中所用引物Table 1 Primers used in this paper

HPLG-?K的定點(diǎn)突變：通過三輪 PCR反應(yīng)，第一輪以構(gòu)建好的pGME-T-HPLG-?K質(zhì)粒為模板，用上游引物 F2和下游突變引物 M；第二輪以EcoRⅠ線性化的 pGME-T-HPLG-?K質(zhì)粒為模板，用第一輪PCR片段為上游引物，與下游引物D進(jìn)行PCR；第三輪用第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以上游引物F2和下游引物D。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳、膠回收、濃度測(cè)定后測(cè)序鑒定RGD-HPLG-?K突變體構(gòu)建成功。

pPICZαA-RGD-HPLG-?K 與 pPICZαA-HPLG-?K的構(gòu)建：將鑒定正確的RGD-HPLG-?K cDNA片段連接pGME-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10進(jìn)行克隆。將pGME-T-HPLG-?K和pGME-T-RGDHPLG-?K采用XhoⅠ、XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、濃度測(cè)定后連接pPICZαA載體，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，涂布于含有25 μg/mL Zeocin的LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，菌落PCR鑒定重組子。

1.2.2 轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母與表達(dá)

pPICZαA-RGD-HPLG-?K的轉(zhuǎn)化與篩選：將構(gòu)建的 pPICZαA-RGD-HPLG-?K質(zhì)粒以 SacⅠ線性化，酚氯仿抽提進(jìn)行純化濃縮，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴斯德畢赤酵母 GS115菌株后，涂布含 100 μg/mL Zeocin YPDS培養(yǎng)板，待長(zhǎng)出菌落后再用無(wú)菌芽簽挑單菌落，分別接種至含 200 μg/mL、800 μg/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)板，篩選高拷貝重組子。同理進(jìn)行pPICZαA-HPLG-?K的轉(zhuǎn)化與篩選。

圖1 pPICZαA-HPLG-?K和 pPICZαA-RGD-HPLG-?K的構(gòu)建Fig. 1 Construction of pPICZαA-HPLG-?K and pPICZαARGD-HPLG-?K.

RGD-HPLG-?K的表達(dá)：從含800 μg/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)板上挑選2個(gè)單克隆菌落，分別接種到30 mL的BMGY液體培養(yǎng)基中，250 r/min、30 ℃培養(yǎng)16~18 h，直到OD600達(dá)到3.0左右。等體積預(yù)冷的滅菌水洗滌，1 500 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌一次。菌體以15 mL的BMMY重懸，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔 12 h取樣 300 μL，樣品 12 000 r/min離心5 min，?20 ℃上清保存，直至培養(yǎng)72 h，其間每隔24 h補(bǔ)加甲醇(終濃度1%)。樣品以還原性12% SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)；纖維蛋白板法鑒定發(fā)酵液活性，HPLG-?K的表達(dá)方法同上。

1.2.3 hPLG-?K與RGD-hPLG-?K的純化與激活

采用Ni-NTA親和介質(zhì)進(jìn)行純化，層析柱 (2.5 cm× 15 cm) 先以A液 (0.05 mol/L KH2PO4-Na2HPO4緩沖液 (pH 7.4)，0.5 mol/L NaCl) 平衡5個(gè)柱床體積，流速為2 mL/min；發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min后，取35 mL上清上樣 (流速1 mL/min)，再以A液沖洗至A280近基線 (流速2 mL/min)。依次以含5、40、500 mmol/L咪唑的A液進(jìn)行階段洗脫 (流速2 mL/min)，收集各階段洗脫峰，12%還原性SDS-PAGE和纖維蛋白板法鑒定目的蛋白組分。合并活性組分，透析除鹽 (透析液：0.02 mol/L KH2PO4-Na2HPO4緩沖液 (pH 7.4)，0.15 mol/L NaCl)和PEG 20000濃縮，冷凍抽干，?20 ℃保存?zhèn)溆?，hPLG-?K制備方法同上。

分別取純化、透析后的hPLG-?K與RGD-hPLG-?K，以100∶1摩爾比加入U(xiǎn)K，37 ℃反應(yīng)24 h，再通過 Ni-NTA親和色譜去除 UK，獲得激活的hPLM-?K與RGD-hPLM-?K，同樣透析、濃縮后冷凍干燥保存。

1.2.4 hPLG-?K、RGD-hPLG-?K的活性測(cè)定與比較

分別取hPLG-?K、RGD-hPLG-?K凍干品，以0.5 mL雙蒸水復(fù)溶，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，再以0.02 mol/L PBS分別調(diào)整hPLG-?K、RGD-hPLG-?K至相同濃度：0.2 mg/mL，0.4 mg/mL。

纖維蛋白板法測(cè)定纖溶活性[11]：1%瓊脂糖凝膠板中含有0.05 mol/L PBS (pH 7.4)、1.5%纖維蛋白、800 U/mL UK、0.02% NaN3。凝膠打孔后，各孔中加等體積的樣品液或PLG陽(yáng)性對(duì)照，37 ℃濕盒保溫過夜。游標(biāo)卡尺測(cè)定溶圈直徑，以溶圈直徑的平方與陽(yáng)性對(duì)照活性作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的比活性。

抗血小板聚集活性[12]：兔心臟取血18 mL加入2 mL 0.109 mol/L的枸椽酸鈉溶液充分混勻，800 r/min離心 10 min，取上清為富血小板血漿(PRP)；剩余血液再以2 500 r/min離心20 min，取上清即為貧血小板血漿 (PPP)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，PPP調(diào)節(jié)PRP使血小板濃度為2.5×108~4.0×108/mL。將PRP、PPP轉(zhuǎn)移至硅化的三角瓶中室溫保存，1 h內(nèi)用血小板聚集儀分別測(cè)定hPLG-?K、RGD-hPLG-?K及其激活產(chǎn)物的血小板聚集抑制率 (Ri)。測(cè)定時(shí)，將200 μL PRP加入攪拌子后調(diào)零，加入5 μL ADP (終濃度10 μmol/L)，反應(yīng)5 min，記錄最大聚集率 (PAGm)，以此為空白對(duì)照 (PAGm·blank)；樣品測(cè)定時(shí)，200 μL PRP分別加入5 μL 0.4 g/L PLG、PLM 及 hPLG-?K、RGD-hPLG-?K、hPLM-?K、RGD-hPLM-?K制備液，室溫反應(yīng)15 min后檢測(cè)樣品PAGm (PAGm·sample)；hPLG-?K的測(cè)定方法同上。血小板聚集抑制率的計(jì)算公式為：

1.2.5 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pPICZαA-RGD-HPLG-?K的構(gòu)建

以含全長(zhǎng)人 PLG基因 cDNA序列的質(zhì)粒pDNR-LIB-HPLG為模板，經(jīng)第1輪PCR在800 bp附近顯示單一條帶，與理論值778 bp相符，其組成從 5′至 3′依次為：6組氨酸編碼序列、HPLG-?K cDNA片段、XbaⅠ酶切位點(diǎn)。第2輪PCR進(jìn)一步在5′末端依次加上XhoⅠ酶切位點(diǎn)、KEX2酶識(shí)別編碼序列，理論長(zhǎng)度792 bp，同樣與電泳結(jié)果一致。再通過3輪PCR構(gòu)建了突變體RGD-HPLG-?K的 cDNA片段 (圖1A)。經(jīng)測(cè)序證實(shí)在指定位置成功將Pro的編碼序列突變?yōu)锳sp (圖1B)。XhoⅠ、XbaⅠ雙酶切表明已成功構(gòu)建了分別包含 HPLG-?K、RGD-HPLG-?K的pPICZαA質(zhì)粒 (圖1C)。

2.2 hPLG-?K與RGD-hPLG-?K的表達(dá)及純化

將構(gòu)建好的HPLG-?K和RGD-HPLG-?K酵母工程菌分別經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)12 h，SDS-PAGE檢測(cè)即顯示出在31 kDa處有單一條帶，與理論計(jì)算的分子量接近，且表達(dá)量在誘導(dǎo)24 h后即達(dá)到峰值，此后 hPLG-?K在 20 kDa位置出現(xiàn)降解條帶，而RGD-hPLG-?K未發(fā)現(xiàn)有降解條帶 (圖2A)，經(jīng)計(jì)算可產(chǎn)生 RGD-hPLG-?K約 0.160 g/L。發(fā)酵液經(jīng) Ni親和層析純化，可見位于97 kDa的雜帶以及大部分的色素不能結(jié)合而流出，通過咪唑洗脫可得到純度90%以上的RGD-hPLG-?K (圖2B)，hPLG-?K的結(jié)果與此相似 (數(shù)據(jù)未顯示)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明RGD-hPLG-?K及hPLG-?K皆可與兔抗人PLG抗血清反應(yīng)，證實(shí)該蛋白為預(yù)期構(gòu)建的蛋白 (圖2C)。

圖2 pPICZαA-RGD-HPLG-?K表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 2 Construction of expression plasmid pPICZαA-RGD-HPLG-?K. (A) PCR for constructing RGD-HPLG-?K. M: DNA marker; 1: subcloning of HPLG-?K; 2: adding Xho I recognizing site to 5 termi of HPLG-?K; 3: PCR products of the first site-directed mutagenesis; 4: PCR products of the second site-directed mutagenesis; 5: PCR products of the third site-directed mutagenesis. (B) Sequence analysis of HPLG-?K and RGD-HPLG-?K. (C) Identification of pPICZαA-HPLG-?K and pPICZαA-RGD-HPLG-?K with Xho I and Xba I. M: DNA marker; 1: pPICZαA-HPLG-?K; 2: pPICZαA-RGD-HPLG-?K; 3: pPICZαA.

圖3 hPLG-?K和RGD-hPLG-?K的表達(dá)、純化及鑒定Fig. 3 Eexpression, purification and identification of hPLG-?K and RGD-hPLG-?K. (A) The expression of HPLG-?K and RGD-HPLG-?K in Pichia pastoris. M: protein marker; 1?5: the expression of HPLG-?K in 0, 12, 24, 36, 48 h, respectively; 6?10: the expression of RGD-HPLG-?K in 0, 12, 24, 36, 48 h, respectively. (B) Purification of RGD-hPLG-?K by Ni-NTA affinity chromatography. M: protein standard; 1: fermentation broth; 2: eluant by buffer A; 3?6: Eluant by buffer A containing 25, 100, 200, 500 mmol/L imidazole. (C) The identification of hPLG-?K and RGD-hPLG-?K by Western blotting with rabbit anti-human plasminogen antiserum. 1: hPLG-?K; 2: RGD-hPLG-?K.

2.3 hPLG-?K、RGD-hPLG-?K的活性測(cè)定與比較

2.3.1 纖維蛋白板法測(cè)定纖溶活性

采用纖維蛋白板法測(cè)定24 h后，以牛血清PLG陽(yáng)性對(duì)照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定所純化 hPLG-?K和RGD-hPLG-?K的比活性分別為 (17.6±4.2) U/mg和(16.3±3.8) U/mg，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析兩者無(wú)顯著區(qū)別(P=0.630，n=5)。

2.3.2 UK激活動(dòng)力學(xué)

通過還原性 SDS-PAGE分析可見未激活RGD-hPLG-?K及hPLG-?K均顯示單一條帶，而被UK激活為RGD-hPLM-?K及hPLm-?K后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，顯示為分子量稍小的條帶。從UK激活RGD-hPLG-?K和hPLG-?K的速率來(lái)看，RGD-hPLG-?K明顯比hPLG-?K要慢，經(jīng)光密度掃描分析顯示：兩者在24 h時(shí)的激活百分比無(wú)顯著差別 (圖5)。

2.3.3 抗血小板聚集活性

對(duì) RGD-hPLG-?K、hPLG-?K以及激活后的RGD-hPLM-?K和hPLM-?K抗血小板聚集活性分析顯示：RGD-hPLG-?K、RGD-hPLM-?K都可以明顯抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，且RGD-hPLG-?K的活性 (36.1%±3.83%) 高于 RGD-hPLM-?K (21.8%±1.57%)，兩者有顯著差別 (P=0.0001，n=5)，兩者都顯著高于hPLM-?K (3.8%±0.33%) (P=0.000，n=5)，PLG及PLM表現(xiàn)弱的抑制活性 (圖6)。

3 討論

人PLG是一種由791個(gè)氨基酸殘基組成的糖蛋白，包含 N端多肽 (NTP)、5個(gè)同源的 Kringle區(qū)(K1-K5)、絲氨酸蛋白酶區(qū) (SP) 7個(gè)結(jié)構(gòu)域。PLG經(jīng)纖溶酶原激活劑 (PA) 特異性水解激活環(huán)上的Arg561-Val562肽鍵后，轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚訮LM，發(fā)揮溶解纖維蛋白的作用。在堿性條件下 (pH 11.0)，Plm可水解Plg Arg530-Lys531肽鍵，產(chǎn)生由部分K5、完整SP區(qū)組成的多肽片段 (Lys531-Asn791)，即微小纖溶酶原(mPlg)，經(jīng)PA激活后具有纖溶活性[13]。

本研究構(gòu)建的hPLG-?K (Pro544-Asn791) 去除了人PLG的所有K區(qū)和部分SP區(qū)序列，其優(yōu)勢(shì)在于：1) 進(jìn)一步縮減了分子量，有利于重組蛋白質(zhì)的復(fù)性，從而增加了利用大腸桿菌獲得高水平表達(dá)的可能性；2) 由于 PLG的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)均位于 K區(qū)[14]，去除K區(qū)后避免了在酵母菌中表達(dá)時(shí)的過糖基化問題；3) K區(qū)的Lys 結(jié)合位點(diǎn)是PLG與促炎癥細(xì)胞上受體相結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域[15-16]，去除后可避免重組蛋白激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而降低溶栓時(shí)可能存在的促炎癥副作用；4) K區(qū)包含PLG與血漿中的抑制物 α2-抗纖溶酶結(jié)合位點(diǎn)[17]，因此去除K區(qū)可能延長(zhǎng)藥物在血漿中的半衰期。

圖4 纖維蛋白板法測(cè)定hPLG-?K and RGD-hPLG-?K的纖溶活性Fig. 4 Fibrinolytic activity assays of hPLG-?K and RGD-hPLG-?K using artificial fibrin plates with urokinase as activator. (A) Fibrin plates. 1: 0.02 mol/L PBS. 2?6: 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.32 U/mL plasminogen respectively. 7?9: 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL hPLG-?K. 10?12: 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL RGD-hPLG-?K. (B) The standard curve of fibrinolytic activity corresponding to the diameter square of fibrinolytic zone in fibrin plates using bovine serum PLG as control.

圖5 UK激活RGD-hPLG-?K和hPLG-?K的動(dòng)力學(xué)分析Fig. 5 UK activation kinetic analysis of RGD-hPLG-?K and hPLG-?K.

圖6 抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集活性Fig. 6 Inhibition of platelet aggregating activity induced by ADP. *P=0.0001, n=5.

圖7 hPLG-?K的結(jié)構(gòu)修飾圖Fig. 7 Diagram of hPLG-?K showing the structural modification. The activation site cleavaged by plasminogen activators (PA) is indicated by the arrow; residue in box identifies site of modification.

在此基礎(chǔ)上我們通過突變激活環(huán)上的 Pro559為Asp559，形成 RGD三肽。激活環(huán)是由 Cys558-Cys566二硫鍵形成的環(huán)袢結(jié)構(gòu) (圖7)，晶體衍射數(shù)據(jù)表明：該9肽的環(huán)袢結(jié)構(gòu)曝露于分子表面，是PLG與其他分子如UK、t-PA、SK、SAK相互作用的主要界面，且位于PLG蛋白水解結(jié)構(gòu)域外的單獨(dú)結(jié)構(gòu)域內(nèi)。在PA特異性水解激活環(huán)上的 Arg561-Val562肽鍵后，其下游游離出來(lái)的V562V563G564G565通過二硫鍵旋轉(zhuǎn)進(jìn)入到PLG的催化活性區(qū)，其中末端的Val542與Asp740形成氫鍵，引起結(jié)構(gòu)改變，最終形成活性水解口袋[18-19]。本研究也證實(shí)，將激活環(huán)激活位點(diǎn)上游的RGP突變?yōu)?RGD后不影響其纖溶活性。雖然突變導(dǎo)致UK激活速率的下降，但24 h后激活比率與天然的 hPLG-?K 無(wú)顯著改變。且突變后形成的RGD-hPLG-?K在表達(dá)過程中不易被酵母中的蛋白酶降解，從而有利于提高表達(dá)蛋白的產(chǎn)量。所構(gòu)建的RGD-hPLG-?K能顯著地抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。有研究表明 RGD處于環(huán)袢結(jié)構(gòu)中活性較高[20]，本研究中也發(fā)現(xiàn) RGD-hPLG-?K 激活為RGD-hPLG-?K后，其RGD的環(huán)袢結(jié)構(gòu)被破壞，抑制活性有所下降，但與hPLM-?K相比，其抑制活性仍然提高了約10倍，表明激活后RGD三肽依然位于分子表面，可與血小板充分作用。

總之，本研究成功構(gòu)建了兩種人PLG的突變體，并且利用畢赤酵母系統(tǒng)獲得了高水平的表達(dá)，所得蛋白經(jīng) UK激活后都顯示了良好的纖溶活性，其中含有RGD三肽的突變體具有明顯的抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用，其體內(nèi)活性還有待進(jìn)一步證實(shí)。由于PLM是一種很有潛力的直接溶栓藥物，且廣泛參與炎癥、組織重建、傷口愈合、排卵、腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等，因此PLG的結(jié)構(gòu)與功能研究，對(duì)發(fā)現(xiàn)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的突變體具有重要意義。

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