王哲焱，尉志文，王 勇，贠克明

氯氮平（Clozapine）屬于苯二氮卓類藥物（弱安定劑）。在體內(nèi)吸收快，但排泄慢，長(zhǎng)期服用或大量服用均可引起中毒［1，2］。藥物中毒也見(jiàn)于藥物濫用導(dǎo)致的意外中毒以及麻醉?yè)尳龠@類案件中，向法醫(yī)毒物分析檢驗(yàn)的鑒定工作提出了新的挑戰(zhàn)［3］。因此本文建立生物檢材中氯氮平的氣相色譜和氣相色譜/質(zhì)譜檢測(cè)方法，可應(yīng)用于臨床氯氮平中毒檢驗(yàn)診斷和氯氮平中毒死亡的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 氯氮平標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于公安部，氯氮平片（上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥總廠，批準(zhǔn)文字：國(guó)藥準(zhǔn)字H31021152）；0.5 mol/L NaOH 溶液；SKF525（內(nèi)標(biāo)液）配制成1.0 mg/mL的乙醇儲(chǔ)備液，置冰箱保存；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器及色譜條件 氣相色譜（Finnigan）條件：DB－5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱溫220℃，1 min→20℃/min→280℃，6 min；檢測(cè)器：300℃，空氣60 kPa，氫氣2.3 k Pa，載氣N22.0 mL/min，NPD檢測(cè)器。分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL。氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（Finnigan）條件：DB－5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 m×0.25μm），EI源70ev；質(zhì)量范圍：50－650，柱溫220℃，1 min→20℃/min→280℃，6 min；離子源溫度：250℃，傳輸線溫度：280℃，載氣：He 2.0 m L/min。

1.3 提取和檢測(cè) 取固體檢材1 g或血1 m L，加蒸餾水1 m L，加入內(nèi)標(biāo)液10μL，振蕩，固性檢材超聲細(xì)胞粉碎（JYD－650L智能型）勻漿3 min，0.5 mol/L NaOH 調(diào)p H10，振蕩搖勻，加入5 mL乙醚，振蕩15 min，1800 r/min離心10 min，將上清液移入另一干凈且干燥試管中，重復(fù)萃取一次。40℃恒溫水浴中揮干，20μL無(wú)水乙醇定容，取1μL進(jìn)樣檢測(cè)，保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法和工作曲線法定量。氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)機(jī)分析，選擇離子模式檢測(cè)（SIM），質(zhì)譜圖、質(zhì)量色譜圖定性，氣相色譜檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) Wister大鼠6只，體重（180±10）g，河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h。經(jīng)灌胃勻速注入LD50（351mg/kg）氯氮平，給藥后觀察大鼠的中毒癥狀，2 h立即處死，取心血、心、肝、脾、肺、腎、腦按上述方法條件提取檢測(cè)其中氯氮平含量。

2 結(jié) 果

2.1 氣相色譜圖、質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖1～圖10）

圖10 內(nèi)標(biāo)SKF525A的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖

2.2 響應(yīng)曲線和精密度 取氯氮平標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/m L），用乙醇將母液稀釋成40.0μg/m L、30.0μg/m L、20.0μg/m L、16.0 μg/m L、8.0μg/m L、4.0μg/m L、2.0μg/m L、1.0μg/m L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。分別取1μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，依上述氣相色譜條件下進(jìn)樣。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作線性回歸，得其回歸方程為Y＝8327X－2687（r＝0.987），兩者之間線性關(guān)系良好，經(jīng)t檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），檢出限為30 ng（S/N＞3）。

取濃度為0.2μg/μL、0.4μg/μL、0.8μg/μL的三種標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述氣相色譜條件下每樣品每日測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定3 d，其日內(nèi)、日間保留時(shí)間為（7.80±0.23）min、（7.80±0.17）min。2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和提取回收率 分別取空白肝組織1 g和心血1 m L，各12份，置于離心管中，各加蒸餾水1 m L和內(nèi)標(biāo)液10μL（1 mg/mL），振蕩，按加入氯氮平標(biāo)準(zhǔn)液配制成質(zhì)量濃度為0.1 μg/m L（μg/g）、0.5μg/m L、1μg/m L、2μg/m L、4μg/m L、8 μg/mL、12μg/mL、16μg/m L、18μg/mL、24μg/mL、28 μg/m L、32μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)系列，按1.3檢材提取和檢測(cè)。建立的心血和肝組織中氯氮平檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y＝33.396X＋0.9248（μg/m L）和 Y＝36.947X＋0.1264（μg/g），式中Y為心血或肝組織中氯氮平濃度，x為氯氮平峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值；相關(guān)系數(shù)分別為0.985和0.984；線性范圍均為（0.1～48）μg/m L，最低檢出濃度為0.1μg/m L或 μg/g（S/N＞3）。

取肝組織1 g或心血1 m L，各9份，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品4μg（3份）、8μg（3份）、20μg（3份），按上述方法提取檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率?；厥章屎妥儺愊禂?shù)分別為（91.3±1.5）%～（105.3±1.74）%和1.82～8.72。

2.4 染毒大鼠體內(nèi)氯氮平檢測(cè) 染毒大鼠心血和各臟器中均檢 出氯氮平。大鼠心血、心、肝、脾、肺、腎、腦的含量依次為（19.7±6.9）μg/mL、（5.6±2.3）μg/m L、（25.8±4.0）μg/mL、（34.5±4.7）μg/m L、（13.0±2.2）μg/m L、（20.0±4.3）μg/m L、（40.9±39.6）μg/mL。

3 討 論

已報(bào)道的氯氮平檢測(cè)方法有：HPLC、RP－HPLC、LC－MS/MS、固相微萃?。瓪庀嗌V質(zhì)譜法、GC/MS等［4－11］。但是本文所建立的GC、GC/MS檢測(cè)方法，一方面確保定性準(zhǔn)確，另一方面又保證了定量結(jié)果的準(zhǔn)確。

以SKF525為內(nèi)標(biāo)，其保留時(shí)間（TR＝3.45，氯氮平TR＝7.8）合適，峰型良好，與氯氮平分離度Rs＞2，且與生物檢材中的雜質(zhì)峰分離良好，在較高濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，提取回收率及精密度均達(dá)到檢案要求，且重現(xiàn)性好，靈敏度高，可滿足定性、定量檢驗(yàn)的分析要求，可用于生物檢材中氯氮平含量的定性和定量分析。

本實(shí)驗(yàn)氯氮平染毒大鼠體內(nèi)檢材用上述方法提取、凈化、濃縮后檢驗(yàn)，同樣可獲得穩(wěn)定可靠的分析結(jié)果。結(jié)果顯示，各臟器內(nèi)氯氮平含量變化不大，說(shuō)明生物樣品組成對(duì)氯氮平的檢測(cè)沒(méi)有影響［12］，以心血、肝、肺含量較高，與文獻(xiàn)［13］報(bào)道氯氮平在家兔體內(nèi)分布特點(diǎn)結(jié)果相同。

由于氣相色譜/質(zhì)譜檢測(cè)方法選擇性好，定性準(zhǔn)確，氣相色譜檢測(cè)簡(jiǎn)便，快速，靈敏，定量結(jié)果準(zhǔn)確，因此既可用于氯氮平中毒或死亡案件的法醫(yī)學(xué)鑒定和法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究［14］，也可用于氯氮平中毒的臨床快速檢驗(yàn)診斷。

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