周 彤,于慧美,蘇 靜,鄭向雨,徐 冶,2,孫連坤*

（1.吉林大學(xué)a.08級(jí)臨床醫(yī)學(xué)五年制;b.白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,吉林長(zhǎng)春 130021;2.吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室）

卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)惡性腫瘤之一,死亡率卻居?jì)D科惡性腫瘤首位[1]。術(shù)后常規(guī)治療方案是在細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行以順鉑為主的聯(lián)合化療。順鉑是廣泛使用的化療藥物,但由于原發(fā)或繼發(fā)的多藥耐藥的存在,嚴(yán)重影響了化療的療效及患者預(yù)后[2,3]。已有研究表明,細(xì)胞順鉑耐藥的形成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[4,5]。順鉑能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)形成大量泛素化的未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白,而細(xì)胞內(nèi)絕大部分聚集蛋白和大部分可溶性蛋白通過(guò)自噬途徑清除[6,7]。如果細(xì)胞內(nèi)堆積的錯(cuò)誤折疊蛋白不能及時(shí)清除,就會(huì)引發(fā)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較順鉑誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和SKOV3/DDP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的差異,進(jìn)而探討SKOV3/DDP細(xì)胞順鉑耐藥的機(jī)制,希望為人卵巢癌的臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和SKOV3/DDP購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)院;RT-PCR試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶 、DL2000（TaKaRa）;胎牛血清 、Trizol 、RMPI-1640培養(yǎng)基（Invitrogen）;T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）;質(zhì)粒小抽試劑盒（Takara）;細(xì)胞裂解液（碧云天）;IRE-1α抗體（santa cruz）;PERK抗體（santa cruz）;β-actin 抗體（santa cruz）;XBP-1引物合成（上海生工生物技術(shù)有限公司）,其它試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng),兩種細(xì)胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養(yǎng)。順鉑耐受型細(xì)胞株SKOV3/DDP在培養(yǎng)過(guò)程中需要加入1μg/ml順鉑,以維持SKOV3/DDP細(xì)胞表型及耐藥性。

1.2.2 MTT 細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔板,待細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,按梯度加入不同濃度的順鉑。培養(yǎng)24 h后,每孔加入20μlMTT,孵育4-6 h后,棄掉培養(yǎng)液,每孔加入150μl的DMSO,充分溶解甲瓚。酶標(biāo)儀上選取570 nm波長(zhǎng),測(cè)定各孔的吸光度值,記錄結(jié)果。

1.2.3 XBP-1引物設(shè)計(jì)及RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè) 根據(jù)NCBI提供的XBP-1的序列,利用DNAman設(shè)計(jì)人源的XBP-1引物。XBP-1引物序列為 5′-GAATGAGTGAGCTGGAAC-3′,5′-GGTCCAAGTTGTCCAGAAT-3′。GAPDH引物序列為5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′,5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGT-3′。

順鉑作用兩種細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn),用Trizol裂解并提取總RNA,各取5μg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成cDNA備用。RT-PCR擴(kuò)增XBP-1片段。RT-PCR的反應(yīng)體系為 :sense primer 、antisense primer各為 0.5 μl、2×TaqMaster 10 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 8 μl,總體積為20μ1;反應(yīng)條件如下:94℃,60 s,55℃,30 s;72℃,60 s,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。

1.2.4 Western Blot 順鉑作用兩種細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后,細(xì)胞裂解并提取蛋白,測(cè)濃度后取60μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,采用BIO-RAD轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%的脫脂奶粉封閉膜上的非特異結(jié)合位點(diǎn)后,分別加入1∶200稀釋的 IRE-1α、PERK、β-actin等抗體孵育過(guò)夜后,再分別加入 1∶1 000稀釋的二抗孵育。DAB顯色,凝膠成像系統(tǒng)采集圖像后保存。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)順鉑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞生存率的影響 不同濃度的順鉑分別作用SKOV 3和SKOV3/DDP細(xì)胞24 h,檢測(cè)順鉑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞生存率的影響。結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞對(duì)細(xì)胞均表現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。順鉑作用24 h,SKOV3細(xì)胞的IC50為8.25μg/m l,SKOV3/DDP的IC50為26.13 μg/m l（P＞0.05,n=3）（見(jiàn)圖1）。

2.2 Western b lot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)順鉑（6μg/ml）分別作用SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞0 h、12 h、24 h,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。Western blot分析兩種細(xì)胞在順鉑作用不同時(shí)間點(diǎn)IRE-1α、PERK蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,順鉑明顯激活SKOV3細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)（P＜0.01,n=3）,而對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯影響（P＞0.05,n=3）（見(jiàn)圖2）。

圖1 順鉑對(duì)SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞生存率的影響（*P＜0.05,n=3）

圖2 順鉑對(duì)SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（**P＜0.01,n=3）

2.3 RT-PCR檢測(cè)XBP-1mRNA表達(dá) 順鉑分別作用SKOV3和 SKOV3/DDP 細(xì)胞0 h、12 h、24 h,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA。RT-PCR分析,結(jié)果顯示順鉑誘導(dǎo)SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中XBP-1基因表達(dá),但是SKOV3/DDP細(xì)胞中XBP-1基因上調(diào)更明顯（P＜0.01,n=3）（見(jiàn)圖3）。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年有4%的女性惡性腫瘤患者死于卵巢癌[8],目前術(shù)后常規(guī)治療方案是在細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用順鉑為主的化療的綜合治療。順鉑是廣泛使用的一線化療藥物,以順鉑為主的聯(lián)合化療已在卵巢癌、頭頸部腫瘤和肺癌中卓見(jiàn)成效。

圖3 順鉑對(duì)SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞XBP-1基因表達(dá)的影響（**P＜0.01,n=3）

雖然目前順鉑耐藥的機(jī)制還不是很清楚,但是已明確這涉及到多方面因素,包括:①細(xì)胞通過(guò)阻礙順鉑與DNA結(jié)合;②增強(qiáng)解毒性;③提高DNA的修復(fù);④調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá);⑤激活促細(xì)胞存活的一系列基因的表達(dá),如 Bcl-2,Erk-1/2和 NF-kB等[9,10]。最近的研究表明順鉑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)形成錯(cuò)誤折疊蛋白積累,從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。許多生理和病理情況,如缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+耗竭、氧化損傷、高脂飲食、低血糖、病毒感染等均可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊負(fù)荷能力的失衡,導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的堆積,即發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。當(dāng)細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)時(shí),可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)和相關(guān)的降解途徑,清除細(xì)胞內(nèi)積累的錯(cuò)誤折疊的蛋白,減弱細(xì)胞應(yīng)激水平,但是當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷的程度持續(xù)加重不能被恢復(fù)時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

我們的研究發(fā)現(xiàn),SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性存在顯著差異。順鉑（6μg/ml）可以誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生,而同等濃度的順鉑對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白沒(méi)有明顯的影響。XBP-1是一種特殊的基因,一般在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的時(shí)候被激活,激活形式的XBP-1能夠抑制細(xì)胞內(nèi)新蛋白的合成,緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工修飾蛋白的壓力。在我們的結(jié)果中,順鉑明顯激活SKOV3細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá);與SKOV3細(xì)胞相比,SKOV3/DDP細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白水平很低,順鉑對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)不明顯,但能顯著提高XBP-1基因表達(dá)。由此本研究提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在腫瘤化療耐藥機(jī)制中可能具有重要作用,可能為臨床腫瘤治療研究提供新的思路。

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