陳 罡,黨裔武,羅殿中

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西南寧 530021)

RNA干擾(RNAi)已廣泛用于沉默或降低靶基因及靶蛋白的表達(dá)。小干擾RNA(siRNA)必須進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮對基因的沉默作用 ,將外源性siRNA高效地轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞是基因抑制成功與否的關(guān)鍵?；騭iRNA轉(zhuǎn)染方法眾多,如磷酸鈣沉淀法、電穿孔、脂質(zhì)體法、顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法、Magnetofection法等[1]。Magnetofection法是采用磁性納米微粒(Nanoparticles)與siRNA結(jié)合成磁性復(fù)合體,在磁力的作用下進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,該方法還可與其他轉(zhuǎn)染方法如脂質(zhì)體法結(jié)合使用,提高siRNA轉(zhuǎn)染效率[2]。2010年 7月,我們比較了 7種轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)表皮生長因子受體(EGFR)siRNA轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后的基因敲除率,并對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細(xì)胞、FBS、DMEM培養(yǎng)基。靶向EGFR及GAPDH特異性siRNA、EGFR scrambled siRNA、Opti-Mem、Lipofectamine 2000、siPORT Amine、ICAFectin 442、N-TER nanoparticle、X-tremeGENE、polyMagnetofection、combiMAGnetofection轉(zhuǎn)染試劑,cDNA第 1鏈合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒, CellTiter96 AQueous One Solution試劑盒,siGLO和TOX陽性轉(zhuǎn)染試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 EGFR siRNA的合成 EGFR siRNA由Invitrogen設(shè)計(jì)并合成,序列為3′-GCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTAT-5′。陽性GAPDH siRNA購自Invitrogen。Scrambled siRNA通過www.sirnawizard. com/scrambled2.php設(shè)計(jì),并行blast檢驗(yàn),由Eurogentec合成。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。1.2.3 EGFR siRNA轉(zhuǎn)染 采用不同轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。初始細(xì)胞接種密度為 5×104/孔,EGFR siRNA終濃度為40 nM,于24孔板中轉(zhuǎn)染48 h及72 h,篩選作用最佳的試劑。然后,選擇不同劑量的最佳試劑、siRNA濃度以及正反向轉(zhuǎn)染進(jìn)行測試。設(shè)置Mock對照組(加入siRNA稀釋液Opti-Mem,無轉(zhuǎn)染試劑及siRNA)及空白對照組(無任何其他試劑)。由于內(nèi)參基因GAPDH在HepG2細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定[3,4],故選取靶向GAPDH siRNA為轉(zhuǎn)染陽性對照組,轉(zhuǎn)染后測定GAPDH mRNA敲除率。同時(shí)GAPDH對細(xì)胞生長增殖無影響,故轉(zhuǎn)染后測定細(xì)胞增殖情況,評估轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞生長的影響。用CellTiter96 AQueous One Solution試劑盒檢測細(xì)胞存活率,用siGLO和TOX陽性試劑盒檢測轉(zhuǎn)染率。

1.2.4 EGFR mRNA檢測 采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)。根據(jù)已知基因序列自行設(shè)計(jì)EGFR、GAPDH及β-actin引物。GAPDH為EGFR mRNA敲除實(shí)驗(yàn)內(nèi)參照;β-actin為GAPDH mRNA敲除實(shí)驗(yàn)內(nèi)參照。收集各組細(xì)胞,用ABIPRISM 6100 p repstation法抽提細(xì)胞總RNA,用ND-1000 NanoDrop檢測RNA質(zhì)量及濃度。取總RNA各200 ng,加入到10μl的RT反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2μl的cDNA進(jìn)行PCR,觀察溶解曲線。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。采用ΔΔCp法分析結(jié)果,其中ΔCp為每一樣本EGFR mRNA的Cp值與自身內(nèi)參GAPDH mRNA Cp值的差值,即CpEGFR-CpGAPDH,ΔΔCp為siRNA組樣本的ΔCp與陰性對照組樣本的ΔCp的差值(ΔCpsiRNA組-ΔCp對照組)。EGFR基因敲除率=(1-1/2ΔΔCp) ×100%[5]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。樣本均數(shù)比較用 t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同轉(zhuǎn)染試劑的EGFR基因敲除率 Lipofectamine 2000、siPORT Amine transfection、combiMAGnetofection在轉(zhuǎn)染72 h后EGFRmRNA敲除率均超過65%,其中combiMAGnetofection敲除率最高,見表1。

表1 7種轉(zhuǎn)染試劑平均EGFR m RNA敲除率比較(±s)

表1 7種轉(zhuǎn)染試劑平均EGFR m RNA敲除率比較(±s)

注：Mock對照加入相應(yīng)siRNA稀釋液Opti-Mem,無轉(zhuǎn)染試劑及siRNA;空白對照僅為細(xì)胞。

試劑 基因敲除率(%) 48 h 72 h LipofectamineTM 2000 65±2 68±6 siPORT TM Amine Transfection Agent 53±2 69±2 ICAFectin TM 442 siRNA transfection reagent 47±2 57±1 N-TER TM Nanoparticle siRNA Transfection System 45±5 57±10 X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent 35±6 63±3 polyMagnetofection TM-100 42±2 62±2 combiMAGnetofection TM reagent-500 75±2 76±3 Mock對照 1±1 0±2空白對照 3±1 3±1

2.2 combiMAGnetofection的優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件 分別用0.5、1、2μl的combiMAGnetofection及8、40、200 nM的EGFR siRNA轉(zhuǎn)染72 h,結(jié)果顯示,2μl combiMAGnetofection及200 nM EGFR siRNA的組合對基因沉默效率最高(90%±1%),但正向轉(zhuǎn)染基因敲除率與同條件反向轉(zhuǎn)染的基因敲除率相近(P＞0.05),見表2。

2.3 細(xì)胞存活率及轉(zhuǎn)染率 用2μl combiMAGnetofection及200 nM轉(zhuǎn)染陽性對照GAPDH siRNA 48 h及72 h的基因沉默率為 90%±5%、93%±8%,細(xì)胞存活率為 95%±7%及 94%±8%,與轉(zhuǎn)染scrambled siRNA的細(xì)胞存活率相近(48 h為96% ±8%,72 h為95%±6%),證明該轉(zhuǎn)染方法細(xì)胞毒性小。使用該轉(zhuǎn)染條件,48 h轉(zhuǎn)染率 ＞87%,72 h轉(zhuǎn)染率＞95%。

表2 不同劑量combiM AGnetofection、不同濃度EGFR siRNA、正反向轉(zhuǎn)染EGFR m RNA敲除率比較

3 討論

siRNA轉(zhuǎn)染的方法眾多,但各有優(yōu)缺點(diǎn)。磷酸鈣沉淀法將氯化鈣、RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合,形成不溶的磷酸鈣顆粒,該顆粒黏附到細(xì)胞膜并通過胞飲進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要,該方法重復(fù)性差,轉(zhuǎn)染效率低。電穿孔法的原理是通過將細(xì)胞暴露在短暫的高場強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,因?yàn)檫^高的場強(qiáng)和過長的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞,一般成功的電穿孔過程都伴隨高水平的細(xì)胞毒性。顯微注射法使用微吸管吸取siRNA溶液,在顯微鏡下將siRNA注射進(jìn)細(xì)胞核,轉(zhuǎn)染率高,對細(xì)胞無毒害,但技術(shù)要求高,操作繁瑣。逆轉(zhuǎn)錄病毒法轉(zhuǎn)染效率高,但構(gòu)建病毒載體耗時(shí)長且價(jià)格昂貴,尤其不適合于有效片段的篩選實(shí)驗(yàn)[1]。陽離子脂質(zhì)體帶正電,可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面,容易透過細(xì)胞膜,在各種體外培養(yǎng)細(xì)胞的 RNA干擾實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用[6],但仍有一定的細(xì)胞毒作用,而且轉(zhuǎn)染效率低 。Magnetofection方法在磁力的作用下進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染,還可與其他轉(zhuǎn)染方法結(jié)合使用,提高siRNA轉(zhuǎn)染效率[2]。本研究發(fā)現(xiàn),Magnetofection聯(lián)合Lipofectamine2000,即combiMAGnetofection介導(dǎo)EGFR siRNA轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞48 h及72 h,都獲得了比其他方法更高的基因敲除率,為siRNA轉(zhuǎn)染提供了新的介質(zhì)選擇。

基因敲除率受轉(zhuǎn)染方法、轉(zhuǎn)染細(xì)胞狀態(tài)、siRNA濃度、轉(zhuǎn)染試劑的用量、轉(zhuǎn)染復(fù)合物的孵育時(shí)間、培養(yǎng)液中血清和抗生素含量等影響[1]。轉(zhuǎn)染試劑與siRNA過量可引起細(xì)胞形狀改變,細(xì)胞脫落,甚至死亡,直接影響RNAi的效率,故對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化是成功的RNAi實(shí)驗(yàn)的前提。本研究發(fā)現(xiàn),combiMAGnetofection介導(dǎo)EGFR siRNA轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞最佳的實(shí)驗(yàn)條件是2μl combiMAGnetofection/200 nM siRNA/24孔板/72 h,EGFR mRNA敲除率達(dá)90%。由于EGFR本身對細(xì)胞增殖有影響,故本實(shí)驗(yàn)使用陽性GAPDH siRNA來檢驗(yàn)combiMAGnetofection轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示,在48 h及 72 h,細(xì)胞存活率分別為 95%±7%及 94% ±8%。說明combiMAGnetofection轉(zhuǎn)染對細(xì)胞損傷小,細(xì)胞毒性效應(yīng)低。

反向轉(zhuǎn)染與正向轉(zhuǎn)染的區(qū)別是后者需在轉(zhuǎn)染前1 d接種細(xì)胞鋪板,培養(yǎng)24 h后再加轉(zhuǎn)染復(fù)合物;前者則是先加入轉(zhuǎn)染試劑和siRNA混合物在培養(yǎng)板上共同溫育數(shù)十分鐘,然后加入細(xì)胞鋪板培養(yǎng),其優(yōu)點(diǎn)是節(jié)約培養(yǎng)時(shí)間[7],對某些貼壁重疊生長的細(xì)胞,可使其完全接觸siRNA混合物,提高轉(zhuǎn)染率。但本實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)逆向轉(zhuǎn)染與正向轉(zhuǎn)染的差別。

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