黃 波,郎賢平,王曉東

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000)

小細(xì)胞肺癌手術(shù)治療效果差,雖然對(duì)化療藥物敏感,但很快會(huì)產(chǎn)生耐藥。川芎嗪是川芎的有效成分之一。順鉑是常用化療藥物,對(duì)小細(xì)胞肺癌有一定療效,但后期易出現(xiàn)耐藥。有研究表明,化療藥物與川芎嗪聯(lián)合應(yīng)用,可提高某些惡性腫瘤的治療效果[1]。我們的前期研究證實(shí),川芎嗪聯(lián)合順鉑可抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株增殖[2]。為進(jìn)一步研究其機(jī)制,2009年 6月 ～2010年 9月,我們觀察了川芎嗪、順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞凋亡的影響,并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446。鹽酸川芎嗪注射液,順鉑注射液。小牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基,p53和Bcl-2一抗。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組與培養(yǎng) NCI-H446細(xì)胞株在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將細(xì)胞用胰酶消化,制成單細(xì)胞懸液(1×105/m l),然后分為A、B、C、D組,分別接種于6孔板,每組3個(gè)平行孔,每孔接種細(xì)胞懸液2 ml。A組常規(guī)培養(yǎng),B組加入川芎嗪培養(yǎng)液100μg/ml,C組加入順鉑培養(yǎng)液2 μg/ml,D組加入上述濃度的川芎嗪及順鉑培養(yǎng)液,均繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.2 凋亡細(xì)胞檢測(cè) 吸去各組上清液,常規(guī)消化細(xì)胞;1 500 r/min離心5min,棄上清;PBS重懸細(xì)胞后,移至EP管中,1 500 r/min離心5 min。加5 μl的AnnexinⅤ-FITC溶液和2.5μl的PI至100μl細(xì)胞混懸液中,混合后室溫避光反應(yīng)30 min,加入反應(yīng)緩沖液 400μl,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 各組細(xì)胞p53、Bcl-2蛋白檢測(cè) 采用Western blot法,按試劑盒說明書操作。以NC膜上出現(xiàn)清晰的棕褐色條帶為陽(yáng)性,用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)顯色條帶掃描的灰度值與 β-actin灰度值的比值表示p53、Bcl-2蛋白表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較用 χ2檢驗(yàn)及方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率比較 A組NCI-H446細(xì)胞凋亡率為5.23%±1.01%,B組為16.37%±1.23%, C為19.2%±1.51%,D組為21.2%±1.79%。B、C、D組與A組相比,P均＜0.01;D組與B、C組相比,P均＜0.05。

2.2 各組細(xì)胞Bcl-2、p53蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞Bcl-2、p 53蛋白表達(dá)比較(±s)

表1 各組細(xì)胞Bcl-2、p 53蛋白表達(dá)比較(±s)

注：與A組相比,＊P＜0.05;與B、C組相比,△P＜0.05

組別 Bcl-2 p53 A組 0.87±0.003 5 0.19±0.002 3 B組 0.58±0.004 8＊ 0.31±0.001 4＊C組 0.32±0.003 9＊ 0.46±0.002 5＊D組 0.23±0.001 9＊△ 0.62±0.002 7＊△

3 討論

腫瘤不僅是細(xì)胞增殖和分化異常的疾病,也是細(xì)胞凋亡異常的疾病。細(xì)胞凋亡狀態(tài)及其調(diào)控基因的異常,可導(dǎo)致細(xì)胞生態(tài)平衡紊亂,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞凋亡的抑制是腫瘤發(fā)生的原因之一[3]。

川芎嗪具有抑制腫瘤新生血管形成的作用[4],其機(jī)制與促進(jìn)免疫功能及抑制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。有研究[5]觀察到川芎嗪有抑制肺腺癌 A549細(xì)胞增殖的作用,其抑制 A549細(xì)胞增殖的機(jī)制與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān),并與化療藥物有協(xié)同作用。順鉑主要作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈,形成順鉑-DNA復(fù)合物,干擾DNA復(fù)制,或與核蛋白及胞質(zhì)蛋白結(jié)合。本研究結(jié)果顯示,B、C、D組與A組相比,細(xì)胞凋亡率明顯上升,D組較B、C組上升。即川芎嗪、順鉑聯(lián)合應(yīng)用,細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨(dú)用藥。

Bcl-2是特異性抑制細(xì)胞凋亡的基因[5]。Bcl-2過表達(dá)可使細(xì)胞凋亡受抑制,細(xì)胞存活期延長(zhǎng)并擴(kuò)增,這是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一[6]。本研究結(jié)果顯示,B、C、D組與A組相比,NCI-H446細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低,且D組低于B、C組。說明川芎嗪、順鉑均可降低小細(xì)胞肺癌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá),兩者聯(lián)合應(yīng)用抑制Bcl-2蛋白表達(dá)的能力進(jìn)一步增強(qiáng)。抑癌基因 p53突變是人類癌癥中最頻發(fā)的基因事件之一[7],且與癌癥的演變過程密切相關(guān)。在肺癌中p53突變率為 60%～70%,對(duì)肺癌的早期診斷、預(yù)后判斷和療效觀察均有重要意義[8]。本研究結(jié)果顯示,B、C、D組與A組相比,NCI-H446細(xì)胞p53蛋白表達(dá)明顯增高,D組高于B、C組。說明川芎嗪、順鉑均可增強(qiáng)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的 p53蛋白表達(dá),兩者聯(lián)合應(yīng)用可使 p53蛋白表達(dá)進(jìn)一步加強(qiáng)。

綜上所述,川芎嗪、順鉑聯(lián)合應(yīng)用,小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞凋亡明顯增加,可能與其降低小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)、增強(qiáng)p53蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1]張會(huì)軍,閻蘊(yùn)力,陰梅云.川芎嗪對(duì)依托泊苷誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的增敏作用[J].實(shí)用腫瘤雜志,2004,19(3)：229-232.

[2]黃波,劉志良,王曉東.川芎嗪、順鉑對(duì)小細(xì)胞肺癌 NCI-H446細(xì)胞株體外增殖的影響[J].山東醫(yī)藥,2010,50(42)：72-73.

[3]張曉暉,姚天明,黃高昇.細(xì)胞凋亡的最新研究進(jìn)展[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(Suppl 1)：42-44

[4]徐曉玉,嚴(yán)鵬科,陳剛,等.川芎嗪對(duì)小鼠肺癌血管生長(zhǎng)和VEGF表達(dá)的抑制[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2004,20(2)：151-154.

[5]Cory S,Huang DC,Adam JM.The Bcl-2 family：roles in cell survival and oncogenesis[J].Oncogene,2003,22(53)：8590-8607.

[6]馬紅,馬曉春.p53、Bcl-2蛋白在人類肺癌組織中表達(dá)的研究[J].中國(guó)冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2003,20(5)：333-335.

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