杜亞明,鄭 偉,王中彬＊,劉長軍,蘇 鵬

(1遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121001;2武警遼寧省總隊醫(yī)院; 3鞍山市第二醫(yī)院;4遼陽市中心醫(yī)院)

大蒜素具有抗癌、防癌作用[1]。目前,有關大蒜素在消化道腫瘤中的作用研究較多,而在肺癌中的作用研究較少。2010年 4～10月,我們觀察了大蒜素對人肺癌 H460細胞增殖及凋亡的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 H460細胞。大蒜素注射液(12 mg /ml)配制成100 mmol/L的溶液,0℃避光保存; RPMI1640培養(yǎng)液,胰蛋白酶,胎牛血清(FBS),吖啶橙試劑(AO),MTT,Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒。TEHER二氧化碳孵箱,TDGC-2J-1超凈工作臺,Olympus倒置顯微鏡和熒光顯微鏡,流式細胞儀,TGL-16G高速冷凍離心機,G3022酶聯(lián)免疫檢測儀,DHG-9030A數(shù)顯氣浴恒溫干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H460細胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),2 d換液 1次,至細胞處于對數(shù)生長期、長滿培養(yǎng)瓶底面積約80%;用0.25%胰蛋白酶消化傳代,按105/m l接種于 50m l培養(yǎng)瓶中。

1.2.2 大蒜素對 H460細胞增殖作用觀察 采用MTT法。取對數(shù)生長期的H460細胞,以1×104/ml接種于96孔板,100μl/孔,置 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)過夜(6～12 h)。細胞貼壁后,實驗組分別加入12.5、25、50、100μmol/L的大蒜素,并分別培養(yǎng)24、48、72 h,每個濃度、每個時點均設 4個復孔,對照組設1個復孔。終止培養(yǎng)前4 h,每孔加入MTT溶液20μl,繼續(xù)培養(yǎng);終止時吸棄上清液,每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO),微孔板震蕩器上震蕩10min,用酶標儀于570 nm處測定各孔吸光度值(OD值)。細胞增殖率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 大蒜素對 H460細胞凋亡作用觀察 取對數(shù)生長期的 H460細胞,以 5×105/m l接種于 6孔板,2 ml/孔。分別加入0、12.5、25、50、100μmol/L的大蒜素作用24 h,離心后,收集H460細胞;PBS洗滌3次,加入碘化丙啶(PI),避光染色15 min,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較用方差分析和 q檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大蒜素對H460細胞增殖的影響 見表 1。由表 1可見,隨著大蒜素濃度增大、作用時間延長, H460細胞增殖率逐漸降低,呈劑量、時間依賴性(P均＜0.05)。

表1 實驗組不同濃度大蒜素對H 460細胞增殖的影響(±s)

表1 實驗組不同濃度大蒜素對H 460細胞增殖的影響(±s)

大蒜素濃度(μmol/L)細胞增殖率(%) 24 h 48 h 72 h 12.5 93.67±2.18 88.84±2.58 77.12±2.15 25 86.67±0.84 85.01±1.05 74.78±3.59 50 57.89±2.78 46.23±1.63 24.05±3.27 100 43.79±1.48 34.96±2.70 23.23±1.43

2.2 大蒜素對 H460細胞凋亡的影響 大蒜素與H460細胞共培養(yǎng) 24 h后,其濃度為 0、12.5、25、50、100μmol/L時,H 460細胞凋亡率分別為 0.45% ±0.23%、8.54%±1.54%、12.43%±1.95%、29.47%±3.83%、38.69%±6.66%。隨著大蒜素濃度增大,H460細胞凋亡率逐漸升高,呈一定劑量依賴性(P＜0.05)。

3 討論

大蒜素是大蒜特有的含硫化合物,一般被用于抗細菌、病毒和真菌的感染。體外實驗證實,大蒜素能夠直接殺傷腫瘤細胞,或通過調節(jié)機體免疫功能干擾腫瘤細胞的生長等途徑而抑制腫瘤發(fā)生,而且這種抑制作用對生物體幾乎無不良反應。其抗腫瘤作用可能有以下機制：①阻斷致癌物質的合成[1]：亞硝酸鹽是合成強致癌物亞硝胺的前身物,大蒜可降低胃內(nèi)亞硝酸鹽含量,從而影響亞硝胺的合成,進而降低患胃癌的幾率[2]。乙烯雌酚(DES)可使人或動物致癌,Green等[3]研究提示大蒜素可直接抑制DES的代謝,從而預防雌激素誘導的腫瘤的發(fā)生。②抗氧化作用：研究[4]證實,大蒜素能對抗毒物對機體的氧化性損傷,與其所含的巰基和親電子集團具有清除活性氧自由基作用有關。Thomas等[5]研究證實,大蒜素中的有效成分二烯丙基硫醚(DAS)能有效抑制乳腺組織代謝中DES氧化所導致的細胞基因不穩(wěn)定和癌變。③直接殺傷腫瘤細胞：哈敏文等[6]研究發(fā)現(xiàn),大蒜素對胃癌 MGC-803、SGC-7901細胞的生長均有明顯抑制作用,且呈劑量依性。④調節(jié)機體免疫功能：大蒜素作為一種免疫激發(fā)劑,能有效提高NK細胞活性和IL-2水平,增強T淋巴細胞分裂增生及活性[7]。⑤對抗腫瘤藥物的增敏作用和抗耐藥作用：研究[8]發(fā)現(xiàn),適當調整抗癌藥物和大蒜素的劑量,同時增加大蒜素給藥次數(shù),可能使大蒜素發(fā)揮很好的增敏作用。推測大蒜素與其他化療藥聯(lián)合應用,可增強療效,降低耐藥性。

本研究結果顯示,大蒜素在50～100μmol/L濃度范圍內(nèi)可顯著抑制人肺癌 H460細胞的生長,而較低濃度(12.5～25μmol/L)的大蒜素對細胞的生長抑制不明顯;隨著大蒜素濃度的升高,H460細胞凋亡率逐漸升高。我們認為,一定濃度的大蒜素在體外對人肺癌 H460細胞有顯著的生長抑制作用,與其細胞周期阻滯和細胞凋亡有關。當然,其確切機制及體內(nèi)實驗是否有類似結果,有待進一步研究。

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