舒 濤,范振海,吳 芹,楊桂荷,余麗梅,兌丹華

急性梗阻性化膿性膽管炎（acute obstructive suppurative cholangitis,AOSC）是膽管感染中一種嚴(yán)重的疾病,具有發(fā)病急驟、病情兇險(xiǎn)、變化快速、并發(fā)癥多、病死率高等特點(diǎn)。盡管近年來(lái)在外科手術(shù)治療的基礎(chǔ)上,綜合采取抗生素治療、重癥監(jiān)護(hù)和營(yíng)養(yǎng)支持等手段大大提高了該病的治療效果,但仍有較高的病死率[1-2]。

AOSC基本發(fā)病因素為膽管梗阻和細(xì)菌感染,除引起膽管梗阻、膽汁淤積外,且有其他系統(tǒng)和器官的損害,病變發(fā)展至后期常伴休克和多器官功能衰竭。肝損害被認(rèn)為是其中較突出的一種表現(xiàn)。應(yīng)充分認(rèn)識(shí)膽石病導(dǎo)致肝臟損害的危害性,及早采取外科手術(shù)解除膽管梗阻,并控制感染,減低患者的肝臟損害,可顯著改善患者的預(yù)后和降低病死率[3-4]。

胃樂(lè)散（wei-le-san,WLS）在貴州省黔東南地區(qū)民間用于胃炎、膽絞痛、腹瀉的治療,治療胃脘痛效果良好。實(shí)驗(yàn)研究表明,WLS對(duì)消化性潰瘍具有較好的治療作用,并可調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)功能[5-6]。

本研究旨在觀察WLS對(duì)AOSC治療作用、減低血清膽紅素水平、減輕膽管損傷的同時(shí),進(jìn)一步觀察WLS對(duì)AOSC模型大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠32只,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證書(shū)號(hào)為SCXK2002008。

1.1.2 試劑與藥品 WLS主要由白芍、蒼術(shù)、元胡、肉桂等中藥組成,藥材購(gòu)于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房,由遵義醫(yī)學(xué)院藥理教研室根據(jù)民間驗(yàn)方制成散劑,用時(shí)將WLS用蒸餾水配成2%和4%的混懸液,4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。大腸桿菌Fischerichin菌株25922由微生物學(xué)教研室張德剛老師饋贈(zèng)。大腸桿菌培養(yǎng)液（蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、伊紅美艷瓊脂20g、量筒量取牛肉膏1000mL；將蛋白胨10g、氯化鈉5g、牛肉浸膏溶液,于pH值7.6～7.8范圍之間滅菌、分裝、儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?.1.3 主要儀器設(shè)備 TDGC2J-0.5超凈工作臺(tái)（上海先鋒電器廠）、SHA-C控溫水浴振蕩器（深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司）、全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus,Au2700型）、電子分析天平（德國(guó)Sartarius）等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性大鼠32只,體質(zhì)量（250± 20）g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將大鼠隨機(jī)分成4組,分別為假手術(shù)組、模型組、WLS低劑量組（0.2g/kg）、WLS高劑量組（0.4g/kg）,每組8只,分籠喂養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌溶液的制備 大腸桿菌轉(zhuǎn)種于瓊脂蛋白胨斜面培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)24h后。無(wú)菌生理鹽水洗滌,離心沉淀后加適量生理鹽水,用Brown氏細(xì)菌數(shù)量比濁管比濁配成稀釋液,含菌量為1.0×109cfu/mL。

1.2.3 AOSC大鼠模型制備 制模前禁食12h,但不禁水,以10%水合氯醛腹腔麻醉（0.35mL/100g）,仰臥位固定,參照文獻(xiàn)[4-7]的方法,分離膽總管,經(jīng)膽管插管向膽總管內(nèi)注入大腸桿菌O25922稀釋液0.2mL后,不完全結(jié)扎膽總管制備AOSC大鼠模型。假手術(shù)組分離膽總管,但不注射大腸桿菌,也不結(jié)扎膽總管,分層縫合腹腔、腹壁。術(shù)后當(dāng)天,各組分別灌胃給予生理鹽水及相應(yīng)藥物,每天2次。

1.2.4 血液生化檢測(cè) 術(shù)后72h后,予水合氯醛麻醉大鼠,頸總動(dòng)脈取血1.5mL,注入EDTA-K2抗凝管中,送遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)反應(yīng)肝功能指標(biāo)的亮氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aminoleucine transferase,ALT）,天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase,AST）和總膽紅素（total bilirubin,TBIL）。

1.2.5 膽管和肝臟病理學(xué)檢查 術(shù)后72h后,頸動(dòng)脈放血處死大鼠,肉眼檢查膽管和肝臟的大體病理學(xué)變化,并取肝組織置于10%的中性甲醛中固定過(guò)夜,常規(guī)石蠟包埋,切片,乙醇梯度脫水,HE染色,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片,于光鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)的病理變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按完全隨機(jī)對(duì)照設(shè)計(jì)的要求收集整理,所有數(shù)據(jù)以±s表示,全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ONE-WAY ANOVA處理,兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WLS對(duì)AOSC模型大鼠肝功能的影響 與假手術(shù)組相比,模型組及各給藥組血清中反應(yīng)肝功能的重要指標(biāo)ALT和AST水平顯著升高（P＜0.01）；經(jīng)WLS治療72h后,與模型組比較,WLS低劑量組血清中ALT、AST水平明顯降低（P＜0.05）,高劑量組有下降的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,見(jiàn)表1。

表1 WLS對(duì)急性化膿性梗阻性膽管炎大鼠血ALT和AST水平的影響±s,n=8）

表1 WLS對(duì)急性化膿性梗阻性膽管炎大鼠血ALT和AST水平的影響±s,n=8）

*：P＜0.05,**：P＜0.01,與模型組比較；#：P＜0.01,與假手術(shù)組比較。

組別 ALT（U/L） AST（U/L）假手術(shù)組 42.88±17.47** 118.38±29.99**模型組 1113.75±569.15 2569.12±703.85WLS低劑量組 593.00±72.73*# 1558.62±349.53*#WLS高劑量組 626.25±339.27# 2119.75±418.79#

2.2 WLS對(duì)AOSC模型大鼠TBIL水平的影響 與假手術(shù)組相比,模型組和WLS高、低劑量組TBIL水平顯著升高（P＜0.01）；WLS低劑量組治療72h后,與模型組相比,TBIL水平顯著降低（P＜0.01）,而WLS高劑量組TBIL水平卻無(wú)顯著變化（P＞0.05）,見(jiàn)表2。

表2 WLS對(duì)急性化膿性梗阻性膽管炎大鼠血TBIL水平的影響（±s,n=8）

表2 WLS對(duì)急性化膿性梗阻性膽管炎大鼠血TBIL水平的影響（±s,n=8）

*：P＜0.01,與模型組比較；#：P＜0.01,與假手術(shù)組比較。

組別 TBIL（μ mol/L）假手術(shù)組 1.35±0.65*模型組 155.62±17.10WLS低劑量組 112.32±17.38*#WLS高劑量組 148.26±36.20#

2.3 WLS對(duì)AOSC模型大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變的影響模型組大鼠制模后72h剖腹,肉眼可見(jiàn)膽總管擴(kuò)張,肝臟腫大淤血,顆粒增粗,肝臟表面有較多散在膿苔；光鏡下觀察可見(jiàn)膽總管上皮的明顯破壞和組織水腫,肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的空泡變性和壞死,有的融合成片,匯管區(qū)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),中央靜脈及肝竇充血；膽小管擴(kuò)張、淤膽。而假手術(shù)組大鼠膽總管和肝臟肉眼未見(jiàn)明顯異常,鏡下見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞排列呈索狀,無(wú)壞死及變性,肝竇無(wú)擴(kuò)張,血管及膽管結(jié)構(gòu)正常。WLS高、低劑量組大鼠肝臟腫大程度減輕,肝臟表面膿苔減少,肝組織結(jié)構(gòu)保持較好,點(diǎn)、片狀肝細(xì)胞變性、壞死明顯減少,炎細(xì)胞浸潤(rùn)也減少（封3圖1）。

3 討論

膽石病對(duì)肝臟的損害主要發(fā)生在原發(fā)性膽管結(jié)石病,這些損害及其并發(fā)癥常構(gòu)成復(fù)雜的肝外科問(wèn)題。AOSC患者死亡尸解肝膿腫發(fā)生率可高達(dá)80%以上,持久的膽管梗阻可造成阻塞膽管范圍的肝內(nèi)膽汁淤積,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞破壞,膽汁性肝硬化和肝葉、肝段的纖維化、A LT升高等[8]。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均已報(bào)道,隨著急性膽管炎病程的發(fā)展,肝損害也隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重,可形成肝膿腫,直接與血行途徑,以及血行與直接途徑相互影響,引起肝細(xì)胞損傷,降低肝功能,引起膽紅素沉積,導(dǎo)致肝功能衰竭等[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)采用膽管插管注入大腸桿菌的方法并結(jié)扎大鼠膽管建立急性化膿性膽管炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。制?2h后,模型組大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平均顯著高于假手術(shù)組,光鏡下見(jiàn)膽總管擴(kuò)張,肝、膽組織出現(xiàn)大量片狀壞死等顯著病理變化,證明在AOSC模型成功建立的基礎(chǔ)上,由于膽管的阻塞,產(chǎn)生了明顯的肝損害,并導(dǎo)致了肝功能的明顯降低。值得注意的是,盡管WLS高、低劑量組之間,反應(yīng)肝功能變化的大鼠血清ALT、AST水平無(wú)顯著差異,但 WLS低劑量組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平較模型組均顯著降低。且肝臟的組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步證實(shí),WLS高、低劑量組大鼠肝臟腫大程度減輕,肝臟表面膿苔減少,肝小葉結(jié)構(gòu)保持較好,肝細(xì)胞壞死明顯減少,以WLS低劑量組改善更為明顯,表明WLS對(duì)AOSC引起的肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。提示在AOSC外科解除膽管梗阻治療前后,合理配合中藥治療[10-11],在減輕膽管損傷、保護(hù)肝臟等方面WLS可能具有良好的應(yīng)用前景。

文獻(xiàn)報(bào)道WLS組方中蒼術(shù)所含的蒼術(shù)揮發(fā)油具有利尿、抗炎癥、鎮(zhèn)痛等作用；蒼術(shù)具有保肝,并對(duì)大腸桿菌等有較好的殺滅作用[12-13]。肉桂對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌等有明顯抑制作用,并可促進(jìn)血液循環(huán)、發(fā)揮抗炎作用等。白芍及其有效成分具有抗炎、保肝、免疫調(diào)節(jié)等作用[14-15],這些可能是WLS發(fā)揮其減輕AOSC引起肝損傷作用的基礎(chǔ)。至于高劑量組效果不如低劑量組,可能由于隨著劑量增加WLS增高上述指標(biāo)的活性成分開(kāi)始發(fā)揮作用,但其確切機(jī)制有待深入研究。

[1]張?jiān)?曹邦清,曾宏,等.膽囊切除術(shù)后非損傷性黃疸的原因及處理[J].臨床外科雜志,2003,11（4）：262-263.

[2]曹盛世.膽石病導(dǎo)致肝臟損害的處理[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2002,3（5）：35-36.

[3]陸融,崔乃強(qiáng),梅建勛.急性重癥膽管炎模型大鼠肝臟細(xì)胞凋亡和壞死的比較研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2000,6（3）：155-157.

[4]寇麗,薛承銳,齊清會(huì),等.大鼠急性不全梗阻性膽管炎模型的建立[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2005,11（2）： 138-140.

[5]余麗梅,鄧江,孫安盛,等.胃樂(lè)散對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的作用[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,24（5）：388-390.

[6]羅勇,文國(guó)容,余麗梅,等.胃樂(lè)散對(duì)小鼠腸運(yùn)動(dòng)功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].貴州醫(yī)藥,2004,28（2）：120-121.

[7]袁濤,劉宏鳴,賴(lài)曉東,等.TNF-α在急性膽管炎大鼠血漿和膽汁中的變化[J].重慶醫(yī)學(xué),2009,38（20）：2601-2602.

[8]鐘大昌,冉瑞圖.關(guān)于急性梗阻性化膿性膽管炎的幾個(gè)問(wèn)題[J].普外臨床,1986,1：214.

[9]黃鶴光,殷風(fēng)峙,石錚.重癥急性膽管炎伴肝腎功能不全時(shí)的肝腎病理改變[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,1996,13（5）： 298-299.

[10]王志偉,吳印愛(ài),劉獻(xiàn)棠,等.丹參對(duì)急性梗阻性化膿性膽管炎患者術(shù)后肝功能的影響[J].2003,31（4）：88,90.

[11]趙承梅,劉檔梁,宋博毅, .

[J]. ,2002,21（1）：30-31.

[12] , . [J]. ,2006,35（3）：75.

[13]. [J]. ,2009,24（1）： 181-182.

[14] , , , .

[J]. ,2009,26（2）：151-153.

[15], . [J]. ,2008,30（4）：538-541.