曹顯慶,逯嶺松,謝國(guó)明△

（重慶醫(yī)科大學(xué)：1.公共衛(wèi)生學(xué)院；2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 400016）

前列腺癌為老年男性常見(jiàn)惡性疾病之一,其發(fā)病率居全球男性癌癥發(fā)病率的第3位,病死率居第6位[1]。鎘（Cd）是一種有毒重金屬,屬于環(huán)境毒素,在人體內(nèi)可蓄積50年左右,能對(duì)多種器官和組織造成損害,大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)鎘是前列腺致癌物[2-3]。前列腺癌組織中鎘含量明顯增高[4]。鎘的檢測(cè)需要一些敏感性比較高的分析技術(shù),配對(duì)等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）被用于鎘的檢測(cè)[5-6],然而,這種技術(shù)所需設(shè)備過(guò)于昂貴。用配對(duì)等離子體可見(jiàn)光譜法（ICP-OES）對(duì)鎘進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)的敏感性不高,而且測(cè)定前必須進(jìn)行預(yù)濃縮或預(yù)分離[7]。石墨爐原子吸收光譜分析法因其操作簡(jiǎn)單,檢測(cè)的高度敏感性和專一性,是檢測(cè)生物樣本中低含量鎘的最為普遍的方法。在過(guò)去的幾年中,不同的化學(xué)修飾物被報(bào)道作為基體改進(jìn)劑用于鎘檢測(cè)，NH4H2PO4是最傳統(tǒng)的、應(yīng)用最廣泛的基體改進(jìn)劑[8],用于反應(yīng)中使分析物保持穩(wěn)定并除去背景干擾。在被測(cè)定樣品中加入具有針對(duì)性的基體改進(jìn)劑,提高原子化溫度,以確保在灰化階段既能將干擾物質(zhì)去除,又不損失被測(cè)物質(zhì)。本文以1.0% HNO3+0.5%NH4H2PO4作為基體改進(jìn)劑,用石墨爐原子吸收光譜分析法測(cè)定大鼠前列腺組織中的鎘含量,對(duì)化學(xué)改進(jìn)劑及其用量、石墨爐工作條件進(jìn)行研究,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 日立Z-5000型原子分光光度計(jì),配置THGA石墨爐、熱解涂層平臺(tái)石墨管、zeeman偏振效應(yīng)背景校正器、AS-71自動(dòng)進(jìn)樣器、鎘空心陰極燈、millipore純水機(jī)等。

1.2 試劑與溶液 HClO4（優(yōu)級(jí)純）、濃 HNO3（優(yōu)級(jí)純）、 NH4H2PO4（分析純）、氯化鎘溶液（分析純）、生理鹽水、Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液1000μ g/mL（國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心GSB 04-1721-2004）,并用1%HNO3逐漸稀釋成0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0μ g/mL的溶液,以上所用試液均用超純水配制。

1.3 樣本來(lái)源 取健康成年大鼠20只,體質(zhì)量190～230g,每只于前列腺內(nèi)注射0.1%氯化鎘（生理鹽水配制）1次,劑量為2mg/kg體質(zhì)量。

1.4 樣品的初步處理 用超純水多次洗滌后,將大鼠前列腺組織樣品放入真空干燥箱中于90℃烘干2h備用。樣品的消化：用分析天平準(zhǔn)確稱取烘干的組織樣品,加入消化液（濃硝酸∶高氯酸=7∶3）后蓋上表面皿,放在電爐上先小火加熱至樣品溶解,隨后在電熱板上將溫度調(diào)至200℃,消化至液體由黃色變?yōu)闊o(wú)色,蒸發(fā)近干,用1.0%HNO3溶液溶解剩余殘?jiān)?定容備用。

1.5 檢測(cè)原理 取待測(cè)樣本,加入基體改進(jìn)劑后,經(jīng)石墨爐原子化器和zeeman偏振效應(yīng)背景校正器進(jìn)行原子化和背景校正,測(cè)定吸光度,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得Cd含量。

1.6 石墨爐升溫程序 石墨爐原子吸收測(cè)定過(guò)程包括干燥、灰化和原子化3個(gè)階段,其中Cd的揮發(fā)和其他雜質(zhì)的干擾易發(fā)生在灰化和原子化階段。實(shí)驗(yàn)選擇1.0%HNO3+0.5% NH4H2PO4作為基體改進(jìn)劑,主要用于提高樣品的灰化效率和Cd的原子化效率,見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程 分別吸取Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液1000μ g/mL,并用 1%HNO3逐漸稀釋成 0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0μ g/mL的溶液。在選定的試驗(yàn)條件下,測(cè)定樣品的吸光度,儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖1。可以看出,Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.5～5.0μ g/mL范圍內(nèi),與吸光度線性相關(guān)關(guān)系良好?；貧w方程為：Y=0.0561+0.0704X,r=0.9949。從回歸方程可以看出,該方法的靈敏度高,線性關(guān)系好。

表1 石墨爐升溫程序

2.2 方法的準(zhǔn)確度 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)用3份樣本分別加入20.00μ g/mL Cd的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 方法的精密度 將初步處理的樣本按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件隨機(jī)抽取5個(gè)試樣,進(jìn)行3次測(cè)定,RSD值均小于5%,在允許范圍內(nèi),所得結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

3.1 樣品最佳消化方法的選擇 用不同的混合酸對(duì)樣品進(jìn)行消解處理。結(jié)果表明,采用濃硫酸易使樣品碳化,使消解不完全；而使用過(guò)氧化氫和硝酸、硝酸和鹽酸以不同比例混合較費(fèi)時(shí),且有時(shí)消解不完全。當(dāng)使用濃硝酸與高氯酸混合時(shí),消解效果最好,并且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃硝酸和高氯酸以7∶3比例混合時(shí),樣品消解時(shí)間最短,消解最完全,對(duì)各種類型的組織樣品均有較好的消化效果。

3.2 基體改進(jìn)劑的選擇 基于大鼠前列腺組織中基體成分復(fù)雜,直接測(cè)定需將灰化溫度提高以降低背景干擾,而Cd的沸點(diǎn)較低（767℃）,是易揮發(fā)元素,當(dāng)無(wú)基體改進(jìn)劑時(shí),溫度超過(guò)200℃時(shí)就會(huì)在石墨噴霧器處揮發(fā),使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。通過(guò)添加基體改進(jìn)劑的方法進(jìn)行改進(jìn),基體改進(jìn)劑主要是用來(lái)改善石墨爐原子吸收中待測(cè)元素的熱穩(wěn)定性,允許灰化階段采用更高的灰化溫度,保證待測(cè)元素原子化前沒(méi)有損失,從而提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。文獻(xiàn)[7]提出用PdCl2-M g（NO3）2作基體改進(jìn)劑,灰化溫度可達(dá)600℃左右,但實(shí)際操作步驟繁瑣,預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng),所用試劑量大,容易造成試劑污染和待測(cè)物質(zhì)的損失。本實(shí)驗(yàn)用1.0%HNO3+0.5%NH4H2PO4作為基體改進(jìn)劑,可提高灰化溫度至650℃,防止鎘的揮發(fā),即使在灰化階段采取較高的溫度也可保持穩(wěn)定。此外,大鼠前列腺組織的成分比較復(fù)雜,用石墨爐原子吸收光譜分析法檢測(cè)時(shí),基體中的其他物質(zhì)易產(chǎn)生干擾,文獻(xiàn)[9]用NH4NO3-Pd（NO3）2聯(lián)合基體改進(jìn)劑直接檢測(cè)海水中的痕量Cd,當(dāng)加入NH4NO3-Pb（NO3）2時(shí)能夠?qū)Ｋ幕w干擾起到很好的抑制作用,但是在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)出現(xiàn)的峰形不好；使用Mg（NO3）2作為基體改進(jìn)劑測(cè)定Cd標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)的響應(yīng)信號(hào)穩(wěn)定,但是用這種基體改進(jìn)劑測(cè)定大鼠前列腺組織樣本時(shí)所得到的響應(yīng)信號(hào)較差。本實(shí)驗(yàn)還加入適當(dāng)濃度的HNO3用于分解大鼠前列腺組織中的有機(jī)物,能將氯化物轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)的硝酸鹽和氯化氫,考慮到高濃度的HNO3會(huì)減短石墨管的壽命,本實(shí)驗(yàn)將HNO3的濃度設(shè)定為1.0%。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),在大鼠前列腺組織Cd含量檢測(cè)中使用該基體改進(jìn)劑效果顯著,1.0%HNO3+0.5% NH4H2PO4可有效地降低背景吸收,并且不需要復(fù)雜的化學(xué)前處理,從而達(dá)到直接測(cè)定的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,使用1.0%HNO3+0.5%NH4H2PO4作為基體改進(jìn)劑時(shí),有利于有效地分離背景吸收信號(hào)和原子吸收信號(hào),提高原子化效率,Cd的吸光度明顯增強(qiáng)。

本文通過(guò)使用添加了1.0%HNO3+0.5%NH4H2PO4基體改進(jìn)劑的石墨爐原子吸收光譜分析法測(cè)定大鼠前列腺組織中的Cd含量,具有良好的準(zhǔn)確度與精密度,并且簡(jiǎn)單,快速,是一種理想的檢測(cè)鎘的方法。使用該方法可用于研究大鼠前列腺組織鎘含量與前列腺癌進(jìn)展的相互關(guān)系,在臨床診斷前列腺癌、生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)毒物分析方面有很好的應(yīng)用前景。

[1]仲召陽(yáng),劉宏嗚,王東,等.Bayes法前列腺癌多腫瘤標(biāo)志物診斷模式建立及臨床意義[J].重慶醫(yī)學(xué),2010,39（5）： 527-529,532.

[2]Alvarez SM,Gómez NN,Scardapane L,et al.Morphological changes and oxidative stress in rat prostate exposed to a non-carcinogenic dose of cadmium[J].Toxicology Letters,2004,153（3）：365-376.

[3]Zeini Jahromi E,Biadri A,Assadi Y,et al.Dispersive liquid-liquid microextraction combined with graphite furnace atomic absorption spectrometry Ultra trace determination of cadmium in water samples[J].Analytica Chimica Acta，2007,585（2）：305-311.

[4]羅子國(guó),許舸,李堆信.鎘對(duì)大鼠前列腺基細(xì)胞損傷及鋅保護(hù)的超微結(jié)構(gòu)觀察[J].重慶醫(yī)學(xué),2000,29（5）：407-408.

[5]Shi L,Xue DF,Xu HG,et al.Determination of Pb,Cd,Hg and As in three sorts of chinese traditional medicine treating tumor by ICP-MS[J].Spectroscopy and Spectral A-nalysis,2007,27（5）：1036-1037.

[6]王洛夫,張堯,蘭衛(wèi)華,等.RNA干擾沉默雄激素受體基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2010,39（1）：28-30.

[7]劉崇華 ,黃理納,余奕東.微波消解電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測(cè)定塑料中鉛和鎘[J].分析試驗(yàn)室,2005,24（2）：66-69.

[8]Vilar-Farinas M,Barciela-Garcia J,Garc í a-Martin S,et al. Direct determination of cadmium in orujo spirit samples by electrothermal atomic absorption spectrometry：comparative studyofdifferent chemical modifiers[J]. Analytica Chimica Acta,2007,591（2）：231-238.

[9]馬旭,丁永生,龐艷華,等.石墨爐原子吸收加基體改進(jìn)劑測(cè)定海水中鎘[J].分析化學(xué),2005,33（3）：343-346.