藺 芳，付瑞敏，皮川真，時 凱，葉 剛，江景玉，陳慧珍

（1.新鄉(xiāng)學院生命科學與技術系，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.河南教育學院人口與生命科學系，鄭州 450046；3.邦和藥業(yè)股份有限公司，鄭州 450001）

近年來，靈敏、準確的DNA痕量定量方法在生物學研究及應用領域中發(fā)揮著重要的作用。痕量定量方法的靈敏度及準確度均需達到較高的標準。紫外分光光度法是以往使用較多的DNA定量方法，此方法操作簡便，成本低，但存在靈敏度低、測樣量大等問題。目前，檢測外源DNA含量常用的方法是Southern blotting雜交法[1]，此法準確性高、特異性強，但存在費時費力的缺點。而熒光定量法是一種靈敏可靠的DNA定量方法，它將熒光染料與DNA結合，利用熒光分光光度計采集結合后增強的熒光信號，通過DNA標準樣品計算得出樣品DNA的初始濃度。本研究基于SYBR Green I熒光發(fā)光原理，來建立一種痕量DNA快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣品

狂犬疫苗（寧波榮安生物藥業(yè)有限公司）。

1.2 主要試劑和儀器

Protein Precipitation solution和DNA Hydration solution（為Puregene Cell and Tissue Kit中的兩種成分）（德國Qiagen公司）；DNA檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；SYBR Green I、Pico Green和 λDNA（100 μg·mL-1）（美 國 Invitrogen 公 司）；糖 原(Glycogen)（碧云天生物技術研究所）；蛋白酶K、RNA酶、三羥甲基氨基甲烷、異丙醇和十二烷基硫酸鈉（美國Sigma公司）；EDTA(天津市化學試劑三廠)；無水乙醇（天津市科密歐化學試劑有限公司）。多功能酶標儀Varioskan Flash（美國Thermo公司）；LS-45/55熒光／磷光／發(fā)光分光光度計（美國Perkin Elmer公司）；3-18K高速臺式離心機（德國賽多利斯公司）；紫外交聯(lián)儀（新芝科技股份有限公司）；電熱恒溫水浴箱（上海申賢恒溫設備廠）；96孔熒光微量滴定板（美國Costar公司）。

1.3 DNA的抽提

500 μL 樣品加入 10 μL SDS，10 μL Tris-HCl和 15 μL蛋白酶 K，55℃孵育 3 h；加入 5 μL RNAase 37 ℃ 孵 育 1 h；加 入 167 μL Protein Precipitation solution劇烈震蕩20 s，冰浴10 min，16 000 r·min-1離心 5 min；取 620 μL 上清液加入500 μL 異丙醇和 0.5 μL Glycogen于-80℃放置 2 h，16 000 r·min-1離心 30 min；棄上清，加 500 μL 70%乙醇進行洗滌沉淀，16 000 r·min-1離心10 min；棄去上清，待乙醇揮發(fā)盡，用100 μL DNA Hydration solution溶解沉淀，65℃孵育1 h，室溫輕微震蕩過夜，充分溶解DNA[2]。

1.4 SYBR Green I工作濃度的選擇

為了選擇合適SYBR Green I工作濃度，我們將SYBR Green I分別稀釋為 1∶1 000，1∶10 000 和 1∶100 000來繪制DNA的標準曲線（DNA濃度分別為1 600、 800、 400、 200、 100、 50、 25、 12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2和0 ng·mL-1）。

1.5 不同緩沖液體系對SYBR Green I熒光定量的影響

采用不同的緩沖液（即TE緩沖液，PBS緩沖液和PBS+0.5 mol·L-1（NH4）2SO4緩沖液）對標準λDNA稀釋成標準系列（400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2 和 0 ng·mL-1），SYBR Green I采用對應的緩沖液稀釋10 000倍。2 mL DNA溶液+2 mL SYBR Green I稀釋液混合后避光10 min，倒入比色皿中用LS-45/55熒光/磷光/發(fā)光分光光度計在激發(fā)光為485 nm，發(fā)射光為518 nm下測定。每個梯度測兩個值。

1.6 SYBR Green I熒光定量

1.6.1 樣品稀釋

用TE將標準λDNA稀釋成標準系列（400、200、 100、 50、 25、 12.5、 6.25、 3.125、 1.56、0.78、0.39、0.2 和 0 ng·mL-1）。熒光染料 SYBR Green I熒光染料用TE緩沖液稀釋10 000倍。

1.6.2 熒光數據采集

96孔熒光微量滴定板內分別加100 μL標準和樣品稀釋液，每孔再加100 μL用TE稀釋10 000倍的SYBR Green I混合，避光靜止15 min。用多功能酶標儀Varioskan Flash在激發(fā)光為485 nm，發(fā)射光為518 nm下測值。每個標準和樣品做2孔[3-4]。

1.6.3 數據處理

計算每個標準和樣品的OD值，即OD=（OD測定1+OD測定2）/2，以標準DNA各濃度的吸光值為橫坐標，以相應的濃度為縱坐標作圖繪制標準曲線，然后將樣品的吸光值在標準曲線上找到相應的y值，則原樣品 DNA的濃度（ng·mL-1）=y×稀釋倍數/5。

1.7 Southern雜交

按竇志勇等采用的雜交方法處理硝酸纖維素膜[5]，并用點樣器點樣，待檢及已知濃度的DNA對照樣品均先用沸水煮10 min變性，迅速冷卻，20 μL點樣。室溫晾干膜，紫外線照射膜5 min，然后進行預雜交→雜交→洗膜→封閉→加抗體→洗膜→顯色→終止反應，記錄結果。由于采用的500 μL體系抽提樣品 DNA，用 100 μL DNA Hydration solution去溶解DNA，在點膜前根據樣品DNA進行適當的稀釋，點膜用20 μL，故原樣品DNA的濃度（ng·mL-1）=膜上直讀樣品 DNA 濃度×10×稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 不同緩沖液體系對SYBR Green I熒光定量的影響

采用不同緩沖體系對DNA和SYBR Green I進行稀釋并測值，繪制標準曲線（見圖1），記錄讀數（見表1）。

從圖1可以看出，三種緩沖體系的線性關系比較好，相關系數的平方均達到0.99以上。其中，含 0.5 mol·L-1（NH4）2SO4緩沖體系的線性最好，相關系數的平方達到0.9997。但從表1可以看出含0.5 mol·L-1（NH4）2SO4緩沖體系只能檢測DNA濃度高于1.56 ng·mL-1的，它的讀數相對于其他緩沖體系值遠遠偏?。籘E緩沖體系能檢測到50 pg·mL-1，對于檢測痕量DNA很有幫助。

圖1 不同緩沖體系下DNA標準曲線Fig.1 Standard curve of DNA in different buffer system

表1 不同緩沖體系下DNA標準系列吸光讀數Table 1 Absorbance of DNA standard series in different buffer system

2.2 不同稀釋度下SYBR Green I DNA標準曲線

將 SYBR Green I分別稀釋為 1∶1 000，1∶10 000和1∶100 000來繪制DNA的標準曲線。從圖2中可以看出熒光染料在1∶1 000稀釋度時DNA濃度在3.125～1 600 ng·mL-1之間，線性關系較好，相關系數的平方達到0.9991；在1∶10 000稀釋度時DNA濃度在1.56～1 600 ng·mL-1之間，線性關系較好，相關系數的平方達到0.9999；而1∶100 000稀釋度時DNA濃度在0.78～400 ng·mL-1之間，線性關系較好，相關系數的平方達到0.9991。由此可知，熒光染料在1∶10 000稀釋度下其線性范圍比1∶1 000稀釋度廣，這樣可以節(jié)約成本，效果更好。熒光染料在1∶10 000稀釋度時雖然靈敏度高，但線性范圍窄，所以我們選擇熒光染料1∶10 000的稀釋度。

圖2 不同稀釋度下SYBR Green I DNA標準曲線Fig.2 Standard curve of DNA in different SYBR Green I dilution

2.3 熒光法和Southern blotting雜交法的比較

為了進一步驗證建立的痕量DNA測定方法，將4個樣品經改進的方法抽提后同時經熒光法和Southern blotting雜交法檢測DNA的濃度。在Southern blotting雜交法時我們根據樣品DNA的濃度進行稀釋后點膜(樣品3、4在前點膜稀釋10倍)。Southern blotting雜交的結果見圖3。

表2為熒光法和Southern blotting法通過換算后各個樣品抽提前樣品DNA的濃度。由于Southern blotting法是半定量的，不能具體讀出DNA含量。從表2可以看出Southern blotting結果和熒光檢測結果基本可以相互印證。

表2 熒光法和Southern blotting法的對比Table 2 Comparison of fluorescence assay and Southern blotting

3 討論

目前，用于雙鏈DNA定量的熒光染料主要有溴化乙啶（EB）、Hoechst33258、Picogreen及SYBR Green I。EB是一種常用的凝膠染色熒光染料，由于其自身有較高的本底熒光，與RNA及單鏈DNA也有較強的結合能力，因此不適用于特異性雙鏈DNA準確定量研究[6]。Hoechst 33258是一選擇性與dsDNA結合的熒光染料，可檢測到0.01 ng·μL-1的dsDNA樣品[7]，并受蛋白影響較小[8]；但該染料對A-T富含區(qū)有較強的選擇性[9]，并且受DNA長度的限制(<200 bp)[7]。Picogreen是一種嵌入型熒光染料，可以檢測到pg級的dsDNA[10]，由于受ssDNA及蛋白影響較小，可以用于dsDNA的定量[11]，但為了增加方法的靈敏度，定量時需要加入較高濃度的染料[12]，增加了實驗成本。SYBR Green I與Picogreen具有相似的化學性質[13]，但比Picogreen具有更好的熱穩(wěn)定性，因此可作為dsDNA定量檢測。

4 結論

Southern blotting雜交法只是半定量的方法，而熒光法可以根據DNA的標準曲線準確讀出DNA的濃度。熒光法和Southern blotting雜交法相比，更快速，精度更高。熒光法檢測只需30 min，而Southern blotting雜交法需要2 d。同時，利用SYBR Green I進行dsDNA定量時，所需染料濃度較低，受pH、定量體積及時間影響較小，因此是一種靈敏、快速、經濟的dsDNA定量方法。

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