趙正娟 田偉 趙敬軍，2

(1.福建醫(yī)科大學(xué)協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科，福州 350001;2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院，上海 200065)

近年來，隨著醫(yī)療水平的提高，器官移植、骨髓移植等侵入性治療增多，臨床免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素使用增加，人群免疫力降低，導(dǎo)致真菌感染機(jī)會(huì)增加。傳統(tǒng)的菌種鑒定方法 (如分泌物直接鏡檢、培養(yǎng)、生理生化方法)費(fèi)時(shí)費(fèi)力(真菌生長(zhǎng)速度在2 d～3周不等)，存在陽性率低和需要專業(yè)人員操作等局限性。而侵襲性真菌病病死率較高，病情發(fā)展迅速，為了快速準(zhǔn)確地診斷疾病，做到早診斷、早治療、降低死亡率，分子生物學(xué)方法開始用于菌種鑒定。這些方法包括:限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (AFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(RAPD)、末端片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 (tFLP)、脈沖凝膠電泳法(PFGE)、DNA序列分析及多位點(diǎn)序列分型(MLST)等。DNA序列分析方法用于研究生物分類和進(jìn)化，可以克服DNA指紋法的局限性。大量的性狀可以直接觀察到，如堿基的變化與顛換，不活動(dòng)性與有選擇性，核苷酸的變化趨勢(shì)，這些變化在物種系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)都可以以不同的方式表現(xiàn)出來，公開發(fā)表的序列都可以直接用來進(jìn)行比較和分析。

1 DNA序列分析的應(yīng)用

DNA序列分析對(duì)于了解真菌的基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)及分子進(jìn)化關(guān)系等具有十分重要的意義。序列測(cè)定是對(duì)致病真菌分類鑒別的重要手段。目前應(yīng)用較多的為18 S rRNA基因大亞基的D1-D2區(qū)、基因內(nèi)間隔區(qū)IGS(intergenic spacer)、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed spacer)、蛋白編碼區(qū)和一些管家基因。其中ITS區(qū)最為常用。主要原因包括:核糖體上的5.8 S、18 S和28 S rRNA基因有極大的保守性，即存在著廣泛的異種同源性。而由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體，所以ITS片段在進(jìn)化過程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能容忍更多的變異。在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個(gè)種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進(jìn)化特征。ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異比較明顯。這種特點(diǎn)使ITS區(qū)適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。真菌ITS區(qū)長(zhǎng)度一般在550～750 bp(堿基對(duì))，片段較小、易于分析。而且目前已有該區(qū)擴(kuò)增所需的標(biāo)準(zhǔn)通用引物。GenBank等機(jī)構(gòu)已存在該區(qū)標(biāo)準(zhǔn)序列，可以供各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)。但I(xiàn)TS區(qū)一般僅能把菌種鑒定到種復(fù)合體水平，需要利用一些蛋白編碼區(qū)，如β-微管蛋白基因 (βtubulin gene)、鈣調(diào)蛋白基因 (calmodulin gene)、延長(zhǎng)因子-1α 基因 (EF-1α，elongation factor-1α gene)等序列分析把菌株鑒定到種水平。

2 致病真菌鑒定及分型

2.1 致病性念珠菌

引起念珠菌病的主要臨床致病菌是白念珠菌。但由于免疫缺陷患者數(shù)量的日漸增加以及鑒定技術(shù)的進(jìn)步，近來發(fā)現(xiàn)非白念珠菌及某些新變種正在增加。這些新變種存在天然耐唑類藥的菌種，比如克柔念珠菌、光滑念珠菌對(duì)氟康唑不敏感，又因深部念珠菌病致死率較高，亟需找到快速準(zhǔn)確的鑒定方法，以便于選擇敏感藥物進(jìn)行治療，對(duì)指導(dǎo)臨床有重要意義。

早期較多研究人員僅對(duì)念珠菌rRNA基因ITS區(qū)進(jìn)行序列分析。如Frutos RI等［1］對(duì)念珠菌該區(qū)擴(kuò)增后的序列分析，把念珠菌鑒定到種復(fù)合體水平，但有的相似菌株不能鑒別出來;同樣，Ciardo DE等［2］對(duì)113株臨床重要酵母菌ITS區(qū)測(cè)序并與數(shù)據(jù)庫比對(duì)序列，其中98%菌株被鑒定到種水平，只對(duì)ITS1區(qū)或ITS2區(qū)分析有些菌株就能鑒定到種水平，但聯(lián)合應(yīng)用ITS1-5.8S-ITS2區(qū)效率更高。

近幾年研究人員多傾向于應(yīng)用多位點(diǎn)序列分型方法 (multilocus sequence，MLST)對(duì)念珠菌進(jìn)行基因分型。MLST是通過PCR來擴(kuò)增6～8個(gè)管家基因片段，采用DNA測(cè)序方法來比較核苷酸序列多態(tài)性，從而進(jìn)行真菌種內(nèi)分型。Arianna T等［3］對(duì) COX3、L1A1、SADH、SYA1 等 4 種基因進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)原來屬于近平滑念珠菌II組和III組的菌株實(shí)際屬于Candida orthopsilosis和Candida metapsilosis;Chowdhary A 等［4］比 較 了MLST和Ca3特異性探針對(duì)白念珠菌分型分辨力的高低，MLST應(yīng)用 7個(gè)管家基因 CaAAT1a、CaACC1、CaADP1、CaPMI、Ca-SYA1、CaVPS13、CaZWF1b測(cè)序，把來自口腔念珠菌病的37株菌分為23個(gè)基因型，鑒別指數(shù) (辛普森指數(shù)，simpson＇s index of diversity)為97%。Ca3特異性探針法把它們分為21個(gè)基因型，鑒別指數(shù)為95%。結(jié)果表明:在確定白念珠菌基因型時(shí)，MLST法類似于或優(yōu)于Ca3特異性探針法;Norbert B等［5］對(duì)38株光滑念珠菌的RPM2、MTI、Cg6等3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和ERG11基因測(cè)序，把它們分為14個(gè)基因型。隨后對(duì)其中選定的10株菌的 PDR1、NMT1、TRP1、URA3等4個(gè)基因片段測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們屬于這14種基因型中的5種。MLST對(duì)于白念珠菌具有高度分辨力，該技術(shù)簡(jiǎn)便易行，其結(jié)果可以共享，利于實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比較，隨著測(cè)序的自動(dòng)化，它將被廣泛應(yīng)用。http://calbicans.mlst.net上提供了白念珠菌的MLST數(shù)據(jù)庫。

2.2 致病性曲霉

侵襲性曲霉病 (Invasive aspergillosis，IA)是臨床上發(fā)病率較高的機(jī)會(huì)致病性真菌感染。好發(fā)于嚴(yán)重免疫缺陷病患者，已成為白血病、骨髓移植、器官移植患者繼發(fā)感染的重要死亡原因，預(yù)后極差，病死率高。曲霉屬中約有30種機(jī)會(huì)致病菌，但主要是煙曲霉、黃曲霉、土曲霉，尤以煙曲霉為主。從分類學(xué)上，曲霉屬 (genus)被分成7個(gè)亞屬 (subgenera)，亞屬又分為幾個(gè)組 (section)，有人把組(section)稱作種復(fù)合體 (species complex)，以便于區(qū)分種復(fù)合體水平和種水平。例如，煙曲霉種復(fù)合體是指煙曲霉亞屬，煙曲霉組。

早在2000年，Travis H 等［6］就利用 ITS區(qū)對(duì)曲霉標(biāo)準(zhǔn)株、臨床株和其他屬菌株進(jìn)行研究，先用PCR擴(kuò)增該區(qū)，然后測(cè)序，進(jìn)行DNA序列分析，結(jié)果和GenBank的非標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比對(duì)(在此研究之前，GenBank的ITS區(qū)序列數(shù)據(jù)是不完整的或者有些來自于非標(biāo)準(zhǔn)株)，把曲霉屬與其他屬菌株分離出來，如念珠菌屬、隱球菌屬、青霉屬、鐮刀菌屬等，并把曲霉屬鑒定到種水平，幾種常見菌群均能鑒別出來，如黃曲霉、煙曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉等。

隨后幾年里，曲霉屬DNA序列分析比較普遍的圍繞在rRNA基因的 ITS區(qū)、大亞基的 D1-D2區(qū)。為了比較兩區(qū)哪個(gè)更可靠，Hans PH等［7］對(duì)曲霉株rRNA基因ITS區(qū)和大亞基的D1-D2區(qū)的鑒定效率進(jìn)行評(píng)定，對(duì)13株臨床重要曲霉株測(cè)序，各區(qū)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用ITS區(qū)鑒定菌株更可靠，尤其在鑒別相似曲霉株時(shí)。rRNA基因的ITS區(qū)能把曲霉屬鑒定到種復(fù)合體水平，但對(duì)一些形態(tài)學(xué)相似株無法鑒別。為了克服這一難題，有些研究人員引入一些蛋白編碼區(qū)在種復(fù)合體內(nèi)鑒定菌株。如S.Arunmozhi Balajee等［8］對(duì)煙曲霉的變異株做了種系發(fā)育學(xué)分析，即對(duì)5種基因所在區(qū)進(jìn)行測(cè)序:β-微管蛋白基因、細(xì)胞色素B基因、ITS區(qū)等，然后進(jìn)行序列分析，得出此變異株為煙曲霉姊妹株A.lentulus。同年，Seung-Beom H等［9］利用同樣的方法做了更進(jìn)一步的研究，對(duì)煙曲霉變異株的β-微管蛋白、鈣調(diào)蛋白、肌動(dòng)蛋白等基因測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙曲霉應(yīng)分為 4 個(gè)群:A.fumigatus sensu stricto，A.lentulus，A.fumigatiaffinis，A.novofumigatus。Ja＇nos V 等［10］對(duì)曲霉臨床株和其他來源的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法的分析，對(duì)β-微管蛋白基因、鈣調(diào)蛋白基因及ITS區(qū)測(cè)序，結(jié)果確定原本屬于焦曲霉組的菌株實(shí)際上屬于A.calidoustus組。

總之，近年來的研究表明:ITS區(qū)可以把曲霉屬鑒定到種復(fù)合體水平，而β-微管蛋白、鈣調(diào)蛋白等蛋白編碼區(qū)在種復(fù)合體內(nèi)鑒定菌種，能把部分相似株或姐妹株鑒定到種水平。

2.3 致病性鐮刀菌

近幾年來，鐮刀菌已成為引起人類機(jī)會(huì)感染的一種重要絲狀酵母菌，臨床重要鐮刀菌主要包括6個(gè)組［11］:茄病鐮刀菌種復(fù)合體 (FSSC)、尖孢鐮刀菌種復(fù)合體(FOSC)、赤霉鐮刀菌種復(fù)合體 (GFSC)、雙孢鐮刀菌種復(fù)合體 (FDSC)、厚孢鐮刀菌種復(fù)合體 (FCSC)、人肉-木賊鐮刀菌種復(fù)合體(FIESC)。鐮刀菌分型研究的常用位點(diǎn)包括:RNA聚合酶Ⅱ大亞基(RPB2)、EF-1α、rRNA基因的ITS區(qū)和大亞基的D1-D2區(qū)、β-微管蛋白、鈣調(diào)蛋白等基因區(qū)。

2006～2009 年的幾年間，Kerry O＇Donnell的實(shí)驗(yàn)室對(duì)鐮刀菌菌株鑒定以及基因分型做了大量的研究。2006年 Ning Zhang和 Kerry O＇Donnell等［12］對(duì)471株茄病鐮刀菌 (278株來自于人，21株來自于醫(yī)院環(huán)境，172株是其他來源的菌株)進(jìn)行研究，通過對(duì)4個(gè)基因片段 (麥角固醇生物合成基因 (erg-3基因)、翻譯延長(zhǎng)因子1-α(TEF-1α)、rRNA基因的ITS區(qū)和大亞基的 D1-D2區(qū))序列分析，發(fā)現(xiàn)茄病鐮刀菌組分為45個(gè)種系發(fā)育相關(guān)的種，首次把茄病鐮刀菌種復(fù)合體分為3個(gè)分枝，來源于人類的菌株主要在第3分枝，但人類來源的菌株和土壤、植物、動(dòng)物來源的菌株有種系發(fā)育關(guān)系上的親緣性。2007年，Kerry O＇Donnell等［13］通過對(duì) RNA聚合酶Ⅱ大亞基 (RPB2)、rRNA基因ITS區(qū)、EF-1α基因序列分析，以及單獨(dú)對(duì)RPB2基因序列分析，均把鐮刀菌分為6個(gè)組，把親人株歸為第3分枝，包括了18個(gè)種系發(fā)育相關(guān)的種。為了完善這一假說，2008年Kerry O＇Donnell等又采取了新方法分析rRNA基因大亞基的D1-D2區(qū)、RPB2基因、EF-1α基因序列，認(rèn)為所有與人真菌病致病相關(guān)的菌株都屬于第3分枝，包括了至少20種種系發(fā)育相關(guān)的種。2009年，Kerry O＇Donnell等［14］應(yīng)用 MLST 對(duì)人肉-木賊鐮刀菌種復(fù)合體和厚孢鐮刀菌種復(fù)合體進(jìn)行鑒別，從88株人肉-木賊鐮刀菌中鑒別出62種序列類型，從26株厚孢鐮刀菌中鑒別出20種序列類型。TEF-1α、rRNA基因的 ITS區(qū)、大亞基的 D1-D2區(qū)、RPB2、鈣調(diào)蛋白等基因序列對(duì)人肉-木賊鐮刀菌種復(fù)合體和厚孢鐮刀菌種復(fù)合體的鑒別指數(shù)分別為0.985和0.966。利用以上方法，原來被歸為人肉-木賊鐮刀菌種復(fù)合體或厚孢鐮刀菌種復(fù)合體的4株親人株和2株親動(dòng)物株，鑒定為5種新菌株，此前這5種菌株未被報(bào)道能引起人類真菌感染。

除了以上研究人員應(yīng)用的MLST外，有些研究人員僅對(duì)單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，然后做序列分析，就能鑒定菌株到種復(fù)合體水平。如Ana AI等［15］分析了EF-1α基因序列，把鐮刀菌屬鑒別到種復(fù)合體水平，即分為 6個(gè)組，與以上分組一致;F.thapsinum和輪狀鐮刀菌在形態(tài)學(xué)上的鑒別是有爭(zhēng)議的，Mónica Azor等［16］對(duì)兩組菌的 β-微管蛋白基因進(jìn)行測(cè)序，然后經(jīng)BLAST程序分析，發(fā)現(xiàn)4株原來屬于輪狀鐮刀菌種復(fù)合體的菌株實(shí)際上屬于F.thapsinum菌種復(fù)合體;Rafael AO等［17］對(duì)來源于眼角膜炎患者的菌株rRNA基因的ITS區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與眼角膜潰瘍感染相關(guān)的4種主要菌株為:茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、人肉-木賊鐮刀菌、雙孢鐮刀菌。

最新研究:2011年李若瑜等［18］對(duì)36株 (其中包括11株參考株和25株臨床株)鐮刀菌做了MLST以及聚合酶鏈反應(yīng)-反向線點(diǎn)雜交技術(shù)(PCR-reverse line blot)的分析。他們選擇7個(gè)區(qū)(TEF-1α、rRNA基因的 ITS區(qū)、LSU區(qū)、IGS區(qū)、RPB2基因、線粒體小亞基mtSSU、鈣調(diào)蛋白基因等)對(duì)鐮刀菌鑒定及分型，把它們鑒定到組。還采用了PCR-RLB技術(shù)，通過選定IGS區(qū)作為靶區(qū)設(shè)計(jì)探針鑒定菌種，經(jīng)對(duì)比兩種方法得出結(jié)論一致。但是PCR-RLB方法成本較高，而且還需要對(duì)更多菌株進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)才能確定它的可行性。2.4 其他致病真菌

除了以上致病真菌，DNA序列分析也用于其他致病真菌的鑒定和分型。Patrick S等［19］對(duì)54株16種接合菌綱的菌株(包括根霉屬、犁頭霉屬、毛霉屬、根毛霉屬等)做了研究，分析ITS區(qū)序列，把它們和其他屬菌株分辨出來，而且ITS區(qū)的種內(nèi)相似性大于98%，種間差異顯著，足以鑒別到種復(fù)合體水平。

為了建立根霉屬的分子發(fā)育史，2006年，Ayumi Abe等［20］對(duì)rRNA基因的18S區(qū)、ITS區(qū)、28S的D1-D2區(qū)測(cè)序，作出種系發(fā)育相關(guān)樹形圖，把根霉屬分為3個(gè)分枝，這與形態(tài)學(xué)分類一致，形態(tài)學(xué)上根霉屬分為3個(gè)群。2007年他們又用同樣的方法對(duì)4個(gè)獨(dú)立的基因區(qū)(rDNA的ITS區(qū)、ldhB基因、act1基因、TEF-1α基因)測(cè)序，然后做樹形圖分析，把米根霉分為兩個(gè)種:產(chǎn)乳酸的米根霉和產(chǎn)富馬酸-蘋果酸的R.delemar。Nyilasi I等［21］通過對(duì)高親和力鐵通透性酶(FTR1)基因序列分析，可以把并頭狀菌屬和根霉屬鑒別開，并能把根霉屬鑒定到種水平，還能把Mucor-Backusella群和其他菌群區(qū)分出來。Hsin CL等［22］應(yīng)用rRNA基因的ITS區(qū)、D1-D2區(qū)序列分析，對(duì)皮膚癬菌進(jìn)行分類，把皮膚癬菌鑒別為小孢子菌屬、表皮癬菌屬、毛癬菌屬。以前被認(rèn)為是趾間毛癬菌的菌株實(shí)際上是須癬毛癬菌，而且把紅色毛癬菌和犬小孢子菌鑒定到種水平。Fanrong Kong等［23］對(duì)42株皮膚癬菌的rRNA基因的ITS區(qū)序列分析，把這42株菌分為7種:紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、地球毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌、絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌、石膏小孢子菌。

3 小 結(jié)

以上研究表明，DNA序列分析是一種敏感性高、特異性好的鑒定菌種的方法。關(guān)鍵問題是選擇哪個(gè)目的擴(kuò)增區(qū)，當(dāng)決定用哪一個(gè)區(qū)或用區(qū)的數(shù)目時(shí)，要考慮一個(gè)重要的問題，就是是否需要把每株菌都鑒定到種水平。有些偶發(fā)菌株不具有代表性，在不了解它們?cè)诩膊≈兴鸾巧珪r(shí)，耗資鑒定這些菌株到種水平是浪費(fèi)資源的。如果只需鑒定到種復(fù)合體水平，選擇ITS區(qū)就足夠了，臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)制定了真菌和細(xì)菌通過DNA靶基因測(cè)序鑒定的判定標(biāo)準(zhǔn)［24］，其中對(duì)真菌最普遍的靶點(diǎn)ITS區(qū)序列分析的質(zhì)控做了詳細(xì)描述。如果研究對(duì)象是高危人群，鑒定到種水平能顯示疾病病原體，幫助選擇和監(jiān)控抗真菌藥的療效，并有助于流行病學(xué)調(diào)查以便得出有效控制感染的措施，這時(shí)要選擇多位點(diǎn)序列分析方法。

由于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法耗時(shí)，缺乏統(tǒng)一的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，主觀性強(qiáng)，菌株表型特征多變，且需要專業(yè)人員操作，給一些臨床真菌實(shí)驗(yàn)室?guī)砹瞬槐?。DNA序列分析方法以客觀、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，越來越受到各臨床真菌實(shí)驗(yàn)室的青睞，已成為鑒別致病真菌的最可靠方法。盡管還存在一些待完善之處:GenBank數(shù)據(jù)庫還不完整，有些基因序列無法比對(duì);DNA序列分析成本較高，不適于較大樣本的菌株鑒別;對(duì)臨床真菌實(shí)驗(yàn)室硬件要求較高。但我們相信，在不久的將來，這些問題能迎刃而解，使DNA序列分析方法廣泛應(yīng)用于鑒定致病真菌，同時(shí)我們也應(yīng)該看到，這些方法并不能完全取代傳統(tǒng)鑒定方法。

［1］Frutos RI，F(xiàn)ernández-Espinar MT，Querol A，et al.Identification of species of the genus Candida by analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2004，85(3):175-185.

［2］Ciardo DE，Schr G，Bttger EC，et al.Internal transcribed spacer sequencing versus biochemical profiling for identification of medically important yeasts［J］.J Microbiol，2006，44(1):77-84.

［3］Arianna T，Amanda DD，Neil ARG，et al.Candida orthopsilosisandCandidametapsilosisspp.nov.to replaceCandida parapsilosisgroups II and III［J］.J Microbiol，2005，43(1):284-292.

［4］Chowdhary A，lee-Yang W，Lasker BA，et al.Comparison of multilocus sequence typing and Ca3 fingerprinting for molecular subtyping clinical isolates ofCandida albicans［J］.Med Mycol，2006，44(5)405-417.

［5］Norbert B，Julius S.Molecular analysis ofCandida glabrataclinical isolates［J］.Mycopathologia，2010，170(2):99-105.

［6］Travis H，Peter CI，Steven HH，et al.Identification ofAspergillusspecies using internal transcribed spacer regions 1 and 2［J］.J Microbiol，2000，38(4):1510-1515.

［7］Hans PH，Steven FH，Timothy JL，et al.Assessment of ribosomal large-subunit D1-D2，internal transcribed spacer 1 and internal transcribed spacer 2 regions as targets for molecular identification of medically importantAspergillusspecies［J］.J Microbiol，2005，43(5):2092-2103.

［8］S.Arunmozhi Balajee，Jennifer LG，Edward H，et al.Aspergillus lentulussp.nov.，a new sibling species ofA.fumigatus［J］.Eukaryotic Cell，2005，4(3):625-632.

［9］Seung-Beom H，Seung-Joo G，Hyeon-Dong S，et al.Polyphasic taxonomy ofAspergillus fumigatusand related species.The mycological society of America［J］.Mycologia，2005，97(6):1316-1329.

［10］Ja＇nos V，Jos H，Henrich AL，et al.Aspergillus calidoustussp.nov.，causative agent of human infections previously assigned toAspergillus ustus［J］.Eukaryotic Cell，2008，7(4):630-638.

［11］Kerry O＇Donnell，Deanna AS，Annette F，et al.Molecular phylogenetic diversity，multilocus haplotype nomenclature，andin vitroantifungal resistance within theFusarium solanispecies complex［J］.J Microbiol，2008，46(8):2477-2490.

［12］Zhang N，Kerry O＇Donnell，Deanna AS，et al.Members of theFusarium solanispecies complex that cause infections in both humans and plants are common in the environment［J］.J Microbiol，2006，44(6):2186-2190.

［13］Kerry O＇Donnell，Brice AJS，Mary B，et al.Phylogenetic diversity and microsphere array-based genotyping of human pathogenic fusaria，including isolates from the multistate contact lens-associated U.S.keratitis outbreaksof 2005 and 2006［J］.J Microbiol，2007，45(7):2235-2248.

［14］Kerry O＇Donnell，Deanna AS，Michael GR，et al.Novel multilocus sequence typing scheme reveals high genetic diversity of human pathogenic members of theFusarium incarnatum-F.equisetiandF.chlamydosporumspecies complexes within the U-nited States［J］.J Microbiol，2009，47(12):3851-3861.

［15］Ana AI，Manuel CE，Araceli M，et al.Antifungal susceptibility profile of clinicalFusariumspp.isolates identified by molecular methods［J］.J Antimicrob Chemoth，2008，61:805-809.

［16］Mónica Azor，Josepa G，Josep C，et al.In vitroantifungal susceptibility and molecular characterization of clinical isolates ofFusariumverticillioides(F.moniliforme)andFusarium thapsinum［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(6):2228-2231.

［17］Rafael AO，Michael RF，Dolena RL，et al.Utility of molecular sequence analysis of the ITS rRNA region for identification ofFusariumspp.from ocular sources［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50(5):2230-2236.

［18］He Wang，Meng X，F(xiàn)anrong K，et al.Accurate and practical identification of 20Fusariumspecies by seven-locus sequence analysis and reverse line blot hybridization，and anin vitroantifungal susceptibility study［J］.J Microbiol，2011，49(5):1890-1898.

［19］Patrick S，Stéphane B，Jean-Charles G，et al.Molecular identification of zygomycetes from culture and experimentally infected tissues［J］.J Microbiol，2006，44(2):340-349.

［20］Ayumi Abe，Yuji Oda，Kozo Asano，et al.The molecular phylogeny of the genus rhizopus based on rDNA sequences［J］.Biosci Bitechnol Biochem，2006，70(10):2387-2393.

［21］Nyilasi I，Papp T，Csernetics A，et al.High-affinity iron permease(FTR1)gene sequence-based molecular identification of clinically important Zygomycetes［J］.Clin Microbiol Infect，2008，14(4):393-397.

［22］Hsin CL，Jean-Philippe B，Mark Ming-Long H，et al.Identification of dermatophytes by sequence analysis of the rRNA gene internal transcribed spacer regions［J］.J Microbiol，2008，57(5):592-600.

［23］Fanrong Kong，Tong ZH，Chen XY，et al.Rapid identification and differentiation ofTrichophytonspecies，based on sequence polymorphisms of the ribosomal internal transcribed spacer regions，by rolling-circle amplification［J］.J Microbiol，2008，46(4):1192-1199.

［24］CLSI.Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing:approved guideline，CLSI document MM18-A［S］.Wayne，PA.Clinical and Laboratory Standards Institute，2008，28(12).