丁玉芹，姜 宏，汪存利

(安徽醫(yī)科大學解放軍臨床學院生殖醫(yī)學中心，安徽合肥 230031)

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，有報道［1］其家族成員細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal regulated protein kinase，ERK)和p38MAPK定位于精子尾部中段，參與精子活動力的調(diào)節(jié);17-β雌二醇可通過PI3K/Akt通路激活ERK，增加精子活動力，并且ERK是在精子由靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫\動過程中逐漸被活化的，抑制內(nèi)源性ERK可以使精子鞭毛活力下降［2-3］。從理論上講，增加或降低ERK和p38的活性可調(diào)節(jié)精子活動力。鑒于此，我們以ERK和p38信號轉(zhuǎn)導通路特異性抑制劑PD98059和SB203580作用于精子細胞，旨在探討PD98059和SB203580對精子ERK和p38MAPK及精子活動力的調(diào)節(jié)作用，為弱精子癥的發(fā)病機制和臨床治療途徑作一探索。

1 資料與方法

1.1研究對象研究對象來自于解放軍105醫(yī)院生殖醫(yī)學中心門診的男性不育患者，按照世界衛(wèi)生組織精液分析標準(1999)，分別收集正常對照組和弱精子癥組標本各15份。每份標本均經(jīng)兩次以上檢查核實，且巴氏染色后精子正常形態(tài)率均＞15%。為避免其它細胞(生精細胞、白細胞和上皮細胞)的污染，按文獻方法［4］，收集精子，PBS調(diào)整精子密度至50 ×106/ml，備用。

1.2PD98059和SB203580對精子活動力的影響

1.2.1濃度對精子活力的影響 將正常對照組和弱精癥組樣本按每孔100 μl分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分為空白對照組、不同濃度PD98059組和不同濃度SB203580組，每組均設(shè)3個復孔取其平均值。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育1 h后，Malker精子計數(shù)板檢測各組精子活動力。

1.2.2 作用時間對精子活力的影響將正常組和弱精癥組精液樣本按每孔100 μl接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分別加入濃度實驗中對精子活動力影響最佳濃度的PD98059，分為空白對照組、80 μmol·L-1PD98059 組和 60 μmol·L-1SB203580組，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別溫育 10、20、40、60 min，觀察PD98059和SB203580干預(yù)不同時間精子活動力的變化。每個時間點均設(shè)3個復孔取其平均值，收集精子，儲存于-196℃液氮中備用。

1.3ERK和p38磷酸化和蛋白表達水平測定取出精子沉淀，用Wsetern blot檢測技術(shù)檢測ERK和p38磷酸化和蛋白表達水平，Quantity One分析軟件分析條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，各組間的差異性比較采用兩組獨立樣本的t檢驗。

2 結(jié)果

2.1不同濃度的PD98059和SB203580對精子活動力的影響正常精子活動力隨PD98059濃度的增加逐漸下降，80 μmol·L-1的PD98059對精子活動力的抑制程度最大;加入SB203580后弱精癥患者精子活動力逐漸增加，濃度60 μmol·L-1時精子活動力升高最為明顯。

2.2PD98059和SB203580作用時間對精子活動力的影響隨著PD98059作用時間的延長，精子活動力逐漸下降，作用40 min精子活動力最低;而SB203580作用10 min后，精子活動力明顯上升，隨著作用的時間延長精子活動力呈下降趨勢。

2.3PD98059和SB203580作用后精子PERK和pp38變化80 μmol·L-1PD98059作用于正常精子40 min后，總ERK表達水平無明顯變化，但PERK/ERK比值明顯下降，兩組比較差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。60 μmol·L-1SB203580作于弱精子組精子10 min后總p38表達水平無明顯變化，但pp38/p38比值明顯下降(P＜0.05)。

3 討論

PD98059是Ras-MAPK通路蛋白激酶MEK(MAPKK)的特異性抑制劑，可特異性地抑制MAPK的磷酸化而阻斷細胞信號轉(zhuǎn)導［5］。SB203580則作用于 p38與 ATP的結(jié)合位點Thr106，可使p38喪失與ATP的結(jié)合能力，從而使其失去激酶活性。本研究中，我們將不同濃度的 PD98059和SB203580分別作用于正常精子和弱精癥患者精子，發(fā)現(xiàn)正常精子隨PD98059作用時間的延長活力逐漸下降，而弱精子癥患者精子則在SB203580作用短時間內(nèi)活力升高，表明MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在調(diào)節(jié)精子活動力中起重要作用。免疫印跡技術(shù)檢測也證實在PD98059干預(yù)后，伴隨著精子活力的降低，ERK的磷酸化水平明顯受抑制，活性下降;而SB203580干預(yù)后，隨精子活力的提高，p38的磷酸化水平明顯受抑制，活性亦下降，進一步證實PD98059和SB203580可通過MAPK信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)精子活動力。

我們在實驗中也觀察到，PD98059和SB203580對精子活動力的調(diào)節(jié)在短時期內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性，但是PD98059和SB203580并不能完全抑制MAPK的活性，這可能與精子細胞內(nèi)存在一個復雜的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，除了MAPK通路外還存在其它信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。從信號轉(zhuǎn)導通路入手可以更精確地探討弱精癥發(fā)病的分子機制，并為研發(fā)治療弱精癥的新藥物提供一定理論和實驗依據(jù)。

［1］Almog T，Lazar S，Reiss N，et al.Identification of extracellular signal regulated kinase1/2 and p38MAPK as regulators of human sperm motility and acrosome reaction and as predictors of poor spermatozoa quality［J］.J Biol Chem，2008，283(21):14479-89.

［2］Aquila S，Sisci D，Gentile M，et al.Estrogen receptor(ER)alpha and ER beta are both expressed in human ejaculated spermatozoa:evidence of their direct interaction with phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt pathway［J］.J Clin Endocrinol Metab，2004，89(3):1443-51.

［3］Lu Q，Sun Q Y，Breitbart H，Chen D Y.Expression and phosphorylation of mitogen-activated protein kinases during spermatogenesis and epididymal sperm maturation in mice［J］.Arch Androl，1999，43(1):55-66.

［4］Ostermeier G C，Dix D J，Miller D，et al.Spermatozoal RNA profiles of normal fertile men［J］.Lancet，2002，360(9335):772-7.

［5］Wu J，Wong W W，Khosravi F，et al.Blocking the Raf/MEK/ERK pathway sensitizes acute myelogenous leukemia cells to lovastatininduced apoptosis［J］.Cancer Res，2004，64(18):6461-8.