劉利寧 王滿俠

(蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

不同類型腦血管病 (CVD)都存在局灶性或全腦缺血，細胞凋亡是腦缺血周邊區(qū)神經(jīng)細胞死亡的主要形式。由于該過程在一定條件下具有可逆性，尋求細胞凋亡與血液循環(huán)障礙相關(guān)器官、組織和細胞缺血性損傷之間的因果關(guān)系及其可能的病理生理機制，利用抗凋亡治療減輕缺血造成的損傷，一直是近年來生物醫(yī)學(xué)研究普遍關(guān)注的熱點。本文就CVD中常見的缺血性腦梗死 (IS)、腦出血 (ICH)以及蛛網(wǎng)膜下腔出血 (SAH)與神經(jīng)元凋亡有關(guān)的問題及抗神經(jīng)元凋亡治療的現(xiàn)狀進行綜述。

1 腦缺血損傷與神經(jīng)元凋亡

傳統(tǒng)觀點認為，缺血性神經(jīng)元死亡僅表現(xiàn)為細胞壞死，而非細胞凋亡。神經(jīng)元細胞壞死通常認為是由興奮性氨基酸谷氨酸或天冬氨酸介導(dǎo)的，但是近年來證據(jù)表明，興奮性氨基酸也廣泛介導(dǎo)了細胞凋亡過程，利用谷氨酸受體拮抗劑可顯著減輕神經(jīng)元凋亡〔1〕。1977年Astrup等在狒狒腦缺血實驗中首次發(fā)現(xiàn)缺血半暗帶(Ischemic Penumbra)，并認為缺血半暗帶中缺血神經(jīng)元達到了電衰竭、能量代謝離子泵功能衰竭的閾值。Endres〔2〕通過總結(jié)多個動物實驗證據(jù)后指出神經(jīng)元凋亡是缺血性半暗帶梗死的主要形式，而凋亡抑制劑有望用于治療急性腦梗死。Linnik等〔3〕于1993年應(yīng)用放線菌酮(蛋白質(zhì)合成抑制劑)降低了大鼠模型局灶性腦缺血模型梗死面積，并指出腦缺血后局部神經(jīng)元過度凋亡是造成再灌注損傷的主要原因之一，也是神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的主要形式。研究提示重度長時間缺血引起神經(jīng)細胞壞死，輕度短時間缺血及再灌注易引起神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡〔4，5〕。神經(jīng)元凋亡是缺血性腦損傷的形式，細胞凋亡加重了缺血再灌注損傷。顯然在這些過程中，細胞凋亡和腦缺血損傷可互為因果，無論是ICH還是SAH，局灶性或全腦缺血都是存在的〔6，7〕，因此腦缺血損傷所致的神經(jīng)元凋亡應(yīng)該普遍存在于CVD病程中。

2 不同類型CVD與神經(jīng)元凋亡

2.1 IS與神經(jīng)元凋亡 IS的病理基礎(chǔ)是血管閉塞，而溶栓或血管重建治療再通血管是理想治療，但由于血管再通卻帶來了一系列缺血再灌注損傷。Abe等〔8〕發(fā)現(xiàn)短暫全腦缺血再灌注4 d后，海馬CA1錐體細胞神經(jīng)元細胞遲發(fā)性死亡，并提出線粒體DNA表達障礙可能導(dǎo)致的線粒體穿梭系統(tǒng)的功能障礙，并可能導(dǎo)致CA1區(qū)神經(jīng)細胞能源生產(chǎn)逐漸衰竭，最終導(dǎo)致細胞死亡。而Du〔9〕則在大鼠頸總動脈及右大腦中動脈閉塞模型中證實嚴(yán)重缺血(90 min)導(dǎo)致典型梗死;30 min的輕度局灶性缺血所致梗死邊緣可在3 d后出現(xiàn)典型細胞凋亡表現(xiàn)，1 mg/kg放線菌酮預(yù)處理可明顯減輕梗死面積，這充分證實了梗死灶周圍存在遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡。因缺血缺氧，線粒體產(chǎn)生氧自由基增多，再灌注時組織產(chǎn)生自由基也增多，胞漿中Ca2+濃度大量增加。二者均使線粒體膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，表現(xiàn)為利用氧能力障礙。Fujimura等〔10〕認為活性氧的產(chǎn)生參與缺血再灌注損傷，活性氧還介導(dǎo)線粒體信號通路，可能導(dǎo)致腦缺血后細胞凋亡，并應(yīng)用過度表達抗氧化劑銅/鋅超氧化物歧化酶的轉(zhuǎn)基因小鼠觀察到其神經(jīng)保護作用。在全大腦缺血大鼠模型中，線粒體功能明顯下降，大量形成的活性氧可加重神經(jīng)元損傷，但線粒體攝取鈣能力并不顯著降低，線粒體通透性改變或凋亡啟動可能是神經(jīng)元損傷的重要機制〔11〕?；钚匝蹩梢砸餌NA甲基化，導(dǎo)致細胞凋亡和細胞活化死亡有關(guān)的基因?；钚匝蹩蓪?dǎo)致bcl-2過度表達和p53基因敲除小鼠的神經(jīng)毒性，并誘發(fā)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活化〔12〕。Shen 等〔13〕認為在缺氧缺糖環(huán)境下，伴隨活性氧的產(chǎn)生和神經(jīng)細胞鈣離子內(nèi)流，神經(jīng)元對煙酰胺呈劑量依賴，煙酰胺可減少即早基因c-fos原癌基因和zif268基因表達，減少缺血再灌注大鼠的神經(jīng)元凋亡而減小梗死面積。

2.2 ICH與神經(jīng)元凋亡 ICH后局部形成血腫，血腫中心的神經(jīng)元壞死不可避免，而血腫周圍的腦組織由于機械壓迫，處于相對缺血狀態(tài)。ICH后血腫周邊繼發(fā)性損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，其具體的損傷機制至今未完全闡明。ICH后的腦損傷是多因素共同作用的綜合表現(xiàn)，包括血腫占位效應(yīng)、神經(jīng)細胞凋亡和壞死、炎癥、血紅蛋白毒性等，是否還有其他損傷機制參與及作用過程還有待更為深入的探討。Nakashima〔14〕應(yīng)用氣囊模型制備的大鼠基底節(jié)區(qū)ICH模型，6 h后可明顯觀察到病灶中心原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)及Fas抗原陽性細胞，24 h后凋亡細胞數(shù)量迅速增加，細胞凋亡可能有助于病灶核心形成，病變卻沒有進一步擴展。Matsushita〔15〕則應(yīng)用0.5 U膠原酶注入大鼠紋狀體致ICH，24 h后，大量TUNEL陽性的凋亡細胞出現(xiàn)在出血中心和邊緣，這些TUNEL陽性細胞主要是神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。應(yīng)用可以穿透細胞膜的廣譜Caspase抑制劑芐氧羰-纈氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-〔O-甲?！?氟甲基酮(zVADfmk)治療可顯著減少TUNEL陽性細胞，而膠原酶等效劑量不誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元細胞死亡。這些的證據(jù)表明，神經(jīng)元凋亡機制可能調(diào)節(jié)TCH后的腦損傷。Levy〔16〕將神經(jīng)母細胞瘤細胞分別置于血紅蛋白，球蛋白、原卟啉、血紅素和鐵中培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn):血紅蛋白、血紅素相對于球蛋白來說是劇毒性的，血紅素處理后的細胞出現(xiàn)DNA降解，Caspase活化和線粒體膜電位下降呈現(xiàn)典型的凋亡細胞死亡模式。抗氧化劑L-乙酰-半胱氨酸或鐵螯合劑去鐵胺可減少血紅素誘導(dǎo)的細胞死亡，表明氧化應(yīng)激在這一有害進程中的作用。因此抗氧化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用鐵螯合劑等抗凋亡治療可有效抵制血紅蛋白毒性。

2.3 SAH與神經(jīng)元凋亡 神經(jīng)元凋亡也存在于SAH。Runnerstam等〔17〕人在兔子彌漫腦損傷伴廣泛SAH模型中監(jiān)測細胞外興奮性氨基酸、顱內(nèi)壓并觀察神經(jīng)元c-Jun基因表達TUNEL陽性細胞。數(shù)小時后海馬細胞外谷氨酸，甘氨酸和?；撬犸@著增加，持續(xù)24 h以后仍高。24 h后海馬和小腦顆粒層出現(xiàn)c-Jun陽性細胞，而大腦皮層卻很少檢測到。接著出現(xiàn)c-Jun陽性的神經(jīng)元核周體和海馬錐體CA4顆粒層及小腦Purkinje細胞。TUNEL陽性細胞在傷后10 d大量出現(xiàn)，凋亡神經(jīng)元廣泛分布于在大腦皮質(zhì)，海馬和小腦。重度腦損傷所致的腦水腫和神經(jīng)元的興奮毒性在1 h內(nèi)出現(xiàn)，24 h后開始出現(xiàn)更廣泛的遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡和細胞死亡。Nau〔18〕對20例SAH進行的尸檢顯示，齒狀回神經(jīng)元細胞凋亡較持續(xù)休克或呼吸衰竭致慢性腦缺氧死亡以及非神經(jīng)系統(tǒng)疾病致死者更常見，死亡于24 h至11 d者，總是出現(xiàn)海馬神經(jīng)元壞死，而非細胞凋亡。腦血管痙攣(CVS)是SAH的重要并發(fā)癥。SAH后，血液或其裂解物進入蛛網(wǎng)膜下腔，有可能刺激機體產(chǎn)生致炎因子而誘發(fā)CVS，而CVS與神經(jīng)元凋亡機制的關(guān)系還不十分清楚。Wang等〔19〕嘗試將肝素化紅細胞溶解液注入兔子小腦延髓池，對照組注入肝素鹽水，處死后切除基底動脈和腦組織切除后固定，觀察到SAH組顳葉神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)平均為26%，對照組僅0.5%，兩組間基底動脈橫截面積無差異，故認為SAH神經(jīng)元凋亡機制可能與CVS無關(guān)。

3 CVD抗神經(jīng)元凋亡治療現(xiàn)狀

神經(jīng)元具有不可再生的特點，CVD治療策略主要是將神經(jīng)元的損害影響降到最低程度，最大限度保留恢復(fù)神經(jīng)功能，減輕致殘率。神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象廣泛存在于各種CVD病程中，這為人們通過抗凋亡治療CVD提供了理論依據(jù)。同時，神經(jīng)元凋亡又是一種遲發(fā)性病變，在一定條件下具有可逆性，因此尋求有效藥物抑制腦缺血后神經(jīng)元過度凋亡是實現(xiàn)腦保護的一條重要途徑。細胞凋亡的途徑包括了線粒體途徑和死亡受體途徑，許多基因、酶、及細胞因子被發(fā)現(xiàn)參與了這些過程。通過修飾這些基因及酶類或者尋找細胞因子及其受體的拮抗劑將能有效干預(yù)細胞凋亡過程。神經(jīng)系統(tǒng)由于血-腦屏障的存在，僅能使相對分子量＜600的小分子物質(zhì)、鏈長＜6個氨基酸的肽、脂溶性藥物能通過血-腦屏障，大多數(shù)藥物卻無法通透而進入腦內(nèi)，使神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療成為難點。血腦屏障的存在使血液循環(huán)中的有害物質(zhì)難以進入腦內(nèi)，同時也使大多數(shù)藥物無法穿越而發(fā)揮其有效治療作用，但是一些陽離子多肽:細胞穿膜多肽(CPP)的發(fā)現(xiàn)使人們看到了希望。CPP是一類不依賴受體介導(dǎo)而可以直接進入細胞內(nèi)的多肽，也有研究者稱這類短肽為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)，或特洛伊木馬肽(Trojan horse peptide)。實驗證明這些多肽分子不但自身能自由進出細胞膜，而且還可以攜帶其他物質(zhì)一同進入細胞，在此過程中細胞膜并不受任何損害，所攜帶的物質(zhì)在細胞中仍表現(xiàn)正常的活性〔20〕。Donnini等〔21〕人將抗凋亡蛋白 Bcl-X(L)的四氫生物蝶呤(BH4)結(jié)構(gòu)域與反式轉(zhuǎn)錄激活因子TAT，一種CPP結(jié)合后，對腦栓塞大鼠進行注射，發(fā)現(xiàn)TAT-BH4可以減少大鼠神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細胞凋亡，加速神經(jīng)干細胞募集，誘導(dǎo)神經(jīng)元的可塑性。因此有理由相信，隨著細胞凋亡機制的進一步闡明及藥物技術(shù)的完善，具有抗凋亡價值的神經(jīng)保護藥物應(yīng)用到CVD臨床治療將為時不遠。

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