劉 敏 楊 俊 李 莉 李書國

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院心內(nèi)科,湖北 宜昌 443003)

RNA干擾(RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯不同水平的基因沉默機制,其可能通過誘導靶基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變,使靶基因的轉(zhuǎn)錄受阻或者抑制靶 mRNA的翻譯,令靶蛋白表達受阻,從而達到高效特異地阻斷基因表達的目的。自從 1998年Fire〔1〕等發(fā)現(xiàn) RNAi現(xiàn)象以來,RNAi研究取得了突破性進展,被《科學》雜志評為 2001年的十大科學進展之一,并名列 2002年十大科學進展之首。目前 RNAi技術廣泛應用于醫(yī)學研究領域,本文就該技術在缺血損傷中的運用做簡要概述。

1 RNAi的發(fā)現(xiàn)

1990年美國和荷蘭的植物學家為了得到比紫色更深的矮牽牛花,遂將產(chǎn)生紫色素的基因轉(zhuǎn)入其中,卻讓大多數(shù)花朵變成了雜色甚至白色,當時認為這是一種奇怪的“協(xié)同抑制”現(xiàn)象。 1995年,康奈爾大學的 Guo等〔2〕在研究線蟲 Par21基因時發(fā)現(xiàn)反義 RNA和正義 RNA都阻斷了基因的表達。1998年華盛頓卡耐基研究所的 Fire研究證明,雙鏈 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)在線蟲體內(nèi)可以產(chǎn)生有效的基因沉默現(xiàn)象,并首次將這種現(xiàn)象稱為 RNAi。2001年,Elbashir等〔3〕第一次在哺乳動物細胞內(nèi)證實了合成的小干擾 RNA(small interfering RNA,siRNA)可以產(chǎn)生 RNAi。 2002年 Brummelkamp等〔4〕發(fā)現(xiàn)了短發(fā)夾 RNA(small hairpin RNA,shRNAs),它可以在細胞內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)源性的 siRNA,從而提供穩(wěn)定的的基因沉默。

2 RNAi的機制

細胞內(nèi)較長的 dsRNA分子被 dsRNA特異性內(nèi)切酶 Dicer(RNaseⅢ)酶切為長度 19～24 nt大小不等的雙鏈 siRNA,在ATP協(xié)助下siRNA的一條鏈與沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合,通過完全配對的方式識別特異性的mRNA,并特異性切割與之互補的靶mRNA,從而阻斷相應基因的表達。同時靶基因的降解產(chǎn)物作為新生的 siRNA繼續(xù)結(jié)合RISC,由此沉默效應被循環(huán)放大〔5〕。此外,siRNA還可以在RNA依賴RNA聚合酶的作用下大量擴增,即以siRNA為引物、以靶mRNA為模板延伸生成 dsRNA,經(jīng) Dicer酶切割、降解生成大量的次級 siRNA,而次級siRNA又可進入合成切割的循環(huán)過程,并進一步放大 siRNA的作用,使RNAi擴散到整個機體并可以傳代〔6〕。

3 RNAi與缺血損傷

3.1 RNAi在心臟缺血損傷中的應用 在缺氧條件下,缺氧誘導因子-1α(hypoxiainducible factor-1alpha,HIF-1α)轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)可以激活幾種下游的血管生長因子。然而,HIF-1α能夠被脯氨酰羥化酶 2(prolyl hydroxylase enzyme-2,PHD-2)蛋白降解。 2008年 Huang等〔7〕通過 shRNA抑制PHD-2可以顯著提高抑制 HIF-1α水平,從而顯著提高心肌梗死后小鼠心功能,并改善心肌梗死區(qū)域毛細血管及小靜脈的生成率。宋慧文等人〔8〕建立了大鼠心肌缺血/再灌注的體外模型,并用蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(protein tyrosine phosphastase-1B,PTP-1B)-RNAi處理心肌細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可顯著減少與 FasR結(jié)合的PTP-1B的數(shù)量,增加了蛋白激酶 B(Akt)的磷酸化水平、并激活 Akt,同時減少了大鼠心肌細胞的凋亡,有效地抑制心肌細胞的損傷。近年來 Lisovyy等〔9〕在研究心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I/RI)機制時,發(fā)現(xiàn)花生四烯酸5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase,ALOX 5)的增加在心肌梗死的病理生理過程中發(fā)揮了重要的致病作用,進一步運用 RNAi技術沉默ALOX5,發(fā)現(xiàn)可以減少大鼠心肌細胞凋亡、保護受損心肌。

3.2 RNAi在腎臟缺血損傷中的應用 補體系統(tǒng)在調(diào)解人腎I/RI有著重要的作用。Zheng等〔10〕試驗證明 siRNA沉默補體活化路徑的核心組成部分C3,可以減輕腎I/RI,從而降低補體介導的腎損傷和小鼠死亡率。Zheng等〔11〕通過夾緊腎靜脈和動脈 25min誘導腎 I/RI損傷,觀察 I/RI損傷 2～48 h,發(fā)現(xiàn) C3和 caspase 3基因顯著上調(diào)。將 C3和 caspase 3 siRNA注入小鼠體內(nèi)可以有效抑制小鼠 C3和 caspase3基因的表達,顯著降低小鼠死亡率及缺血損傷面積。血清糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶 1(serum and glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)的下調(diào)可以促進促紅細胞生成素(EPO)的抗凋亡作用。最近,Rusai等〔12〕在建立大鼠單側(cè)腎 I/RI體內(nèi)模型中,運用 RNAi技術沉默SGK 1,發(fā)現(xiàn)可以對 I/RI的腎臟有保護作用。

3.3 RNAi在腦缺血損傷中的應用 Fas基因表達在細胞凋亡中起重要作用。包曉群等〔13〕通過建立體外神經(jīng)細胞缺血再灌注模型,用 RNAi技術對 Fas基因表達進行抑制,發(fā)現(xiàn) Fas siRNA組較對照組細胞凋亡指數(shù)顯著下降。Bax是B細胞淋巴瘤家族基因-2(Bcl-2)的異源二聚體,有促進細胞凋亡的作用。葉西就等〔14〕通過 Bax-siRNA抑制了大鼠 Bax mRNA的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制了細胞凋亡,減輕了腦缺血再灌注損傷。而 Zheng等〔15〕則在研究大鼠大腦中動脈閉塞模型時發(fā)現(xiàn),運用 RNA干擾技術沉默 Beclin 1基因的表達,可以減少缺血再灌注導致的腦梗死面積及細胞凋亡。

3.4 RNAi在肝缺血損傷中的應用 劉璐等〔16〕發(fā)現(xiàn),對小鼠注射 Fas分子的siRNA后,可以抑制肝臟缺血再灌注后肝細胞Fas分子的表達,從而阻斷由 Fas介導的肝細胞的凋亡,達到對肝臟細胞的保護作用。白細胞介素-1受體相關激酶-4(Inteleukin 1 receptorassociated kinase-4,IRAK-4)是造成再灌注期移植肝臟內(nèi) kupffer細胞(kupffer cells,KCs)過度激活信號通路的最關鍵調(diào)節(jié)因子,而KCs細胞的激活又是誘發(fā) I/RI重要原因之一。因此,劉作金等〔17〕以 IRAK-4為靶點阻斷其胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導,發(fā)現(xiàn)shRNAs轉(zhuǎn)染途徑能有效減輕大鼠肝移植時 I/RI。同樣是研究肝移植 I/RI過程,Schneider等〔18〕發(fā)現(xiàn),運用 RNA干擾技術沉默脯氨酰羥化酶1(prolyl hydroxylaseenzyme 1,PHD1)可以保護肝組織,減少小鼠肝組織 I/RI。

4 小結(jié)

RNAi是科學研究的大熱點,近幾年來該技術在抗病毒、抗腫瘤及臨床相關疾病(如哮喘、濕性老年斑病變、慢性阻塞性肺疾病等)的治療領域中已經(jīng)取得了較大進展,但是該技術目前在缺血損傷方面的應用還停留在動物實驗階段,相信隨著研究的不斷深入,RNAi啟動的特異基因序列沉默將為人類各臟器缺血損傷治療提供基因治療的新方法。

1 Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans〔J〕.Nature,1998;391(6669):806-11.

2 Guo S,Kemphues KJ.Par-1,a generequired for establishing polarity in C elegans embyos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed〔J〕.Cell,1995;81(4):611-20.

3 Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature,2001;411(6836):494-8.

4 Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells〔J〕.Science,2002;296(5567):550-3.

5 Gilmore IR,Fox SP,Hollina AJ,et al.Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing〔J〕.Curr Drug Deliv,2006;3(2):147-51.

6 Hannon GJ.RNA interference〔J〕.Nature,2002;418(6894):244-51.

7 Huang M,Chan DA,Jia F,et al.Short hairpin RNA interference therapy for ischemic heart disease〔J〕.Circulation,2008;118:226-33.

8 宋慧文.PTP-1B小干擾 RNA對缺氧/復氧誘發(fā)的大鼠心肌細胞凋亡的影響〔J〕.華中科技大學學報(醫(yī)學版),2008;37(6):753-6.

9 Lisovyy OO,Dosenko VE,Nagibin VS,et al.Cardioprotective effect of 5-lipoxygenase gene(ALOX5)silencing in ischemia-reperfusion〔J〕.Acta Biochim Pol,2009;56(4):687-94.

10 Zheng X,Feng B,Chen G.Preventing renal ischemia-reperfusion injury using small interfering RNA by targeting complement 3 gene〔J〕.Am J Transplant,2006;6(9):2099-108.

11 Zheng X,Zhang X,Sun H,et al.Protection of renal ischemia injury using combination gene silencing of complement 3 and caspase 3 genes〔J〕.Transplantation,2006;82(12):1781-6.

12 Rusai K,Prokai A,Szebeni B,et al.Role of serum and glucocorticoidregulated kinase-1 in theprotective effects of erythropoietin during renal ischemia/reperfusion injury〔J〕.Biochemical Pharmacology,2010;79(8):1173-81.

13 包曉群,宋冬晶,陳加俊,等 .針對 Fas RNA抑制對缺血再灌注神經(jīng)細胞的保護作用〔J〕.中國老年學雜志,2006;26(11):1524-5.

14 葉西就 .BoiRNA預先給藥對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用〔J〕.中華麻醉學雜志,2006;26(9):853-5.

15 Zheng YQ,Liu JX,Li XZ,et al.RNA interference-mediated downregulation of Beclin1 attenuates cerebral ischemic injury in rats〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2009;30(7):919-27.

16 劉 璐,王 掉,賴東明,等 .RNA干擾技術對小鼠肝臟缺血再灌注中肝細胞損傷的保護作用及其機制〔J〕.中華實驗外科雜志,2004;21(11):1398.

17 劉作金,李生偉,李旭宏,等 .阻斷內(nèi)毒素胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路對大鼠移植肝臟再灌注損傷的影響〔J〕.四川大學學報(醫(yī)學版),2006;37(5):679-82.

18 Schneider M,Van Geyte K,Fraisl P,et al.Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury〔J〕.Gastroenterology,2010;138(3):1143-54.