馮建萍

檢測鼠疫菌培養(yǎng)基的質(zhì)量控制

馮建萍

鼠疫是人獸共患的烈性傳染病。鼠疫疫源地證實(shí),鼠疫疫情的判定是以分離到鼠疫菌為依據(jù)[1],而鼠疫菌分離的主要環(huán)節(jié)是培養(yǎng)基和基礎(chǔ)液赫金格爾消化液的質(zhì)量控制。本文對其制備、貯存、性能測試、影響因素、注意事項(xiàng)等方面應(yīng)采取的質(zhì)量控制進(jìn)行討論。

1 材料與方法

1.1 赫金格爾消化液制備

1.1.1 制作方法 取自來水5 000mL,加入絞碎去脂腱牦牛肉,煮沸30 min并不斷攪拌。待冷卻至56℃加入豬胰臟250 g,無水碳酸鈉50～60 g,充分混勻矯正p H值為7.8,加入氯仿80～100 m L,冷卻以橡皮塞緊塞瓶口,置于37℃溫箱內(nèi)消化7～9 d,每d振蕩3～4次,消化良好時,上清液黃色透明,殘渣沉于瓶底且甚少,保證氨基氮含量達(dá)到500～800 mg/L或更高。

1.1.2 氨基氮含量測定 根據(jù)每毫升N/10氫氧化鈉滴定1.4 mg氨基氮的公式來計算,所得數(shù)字乘以100即為100 m L培養(yǎng)基內(nèi)所含氨基氮的毫克數(shù)。

1.2 培養(yǎng)基制備 按每100 m L培基內(nèi)含75 mg氨基氮的比例,用蒸餾水稀釋消化液,并于其中加入氯化鈉0.3%,磷酸氫二鈉0.1%及瓊脂粉2%,蛋白胨1%,加熱溶解,矯正p H為7.0,121℃30 m in滅菌后傾注平皿即為胰酶消化液瓊脂培養(yǎng)基[2]。

2 質(zhì)量控制

2.1 保存

2.1.1 赫金格爾消化液保存 制備好的消化液用四層紗布,中間夾一層脫脂棉過濾到10 000 m L立形瓶中,并按每5 000 m L消化液加入80～100 m L氯仿,立即以橡皮塞緊塞瓶口,置室溫避光,1個月左右,瓶底出現(xiàn)像石花菜絮狀或結(jié)晶時,再進(jìn)行過濾,測其氨基氮含量(索因森—格夫立洛氏測定法)達(dá)500～800 mg/L或更高即為合格,置室溫陰暗處作為鼠疫菌培養(yǎng)基基礎(chǔ)液備用[2]。

2.1.2 培養(yǎng)基保存 滅菌以后培養(yǎng)基應(yīng)冷卻至所需溫度,避免長時間保存在滅菌鍋內(nèi),造成過度滅菌,影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成份或選擇性效果。所配制好的培養(yǎng)基的量,應(yīng)該在最長保存期限內(nèi)正好使用完,最長期限不要超過1個月,否則培養(yǎng)基失去其凝固水成分而影響鼠疫菌生長,再者其它微生物易生長。在一定期限中更換新鮮培養(yǎng)基備用,配好的肉湯類培養(yǎng)基如果保存時間超過2w,應(yīng)將其放在帶有螺絲蓋的試管或其它密閉的試管,防止蒸發(fā)。各染料的培養(yǎng)基閉光保存,制備好的瓊脂平板應(yīng)冷藏保存(4℃冰箱)。干粉培養(yǎng)基應(yīng)保存在陰涼、干燥處,避免陽光直射,未開瓶的培養(yǎng)基在室溫下最長保存兩年,開瓶后的干粉培養(yǎng)基易吸濕,應(yīng)注意防潮并在6個月內(nèi)用完。應(yīng)定期對儲存中的培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)檢查,如果培養(yǎng)基發(fā)生結(jié)塊、顏色異常和其它變質(zhì)跡象就不能再使用。

2.2 外觀控制

2.2.1 赫金格爾消化液外觀控制 制備好的消化液,上清液應(yīng)黃色透明,殘渣沉于瓶底且甚少,過濾后的殘渣沒有絮狀,無異味。

2.2.2 氨基氮含量 制備好的氨基氮含量用索恩森—格夫立洛夫氏測定法,氨基氮含量達(dá)500～800 mg/L或更高,說明消化良好,按每100 mL培養(yǎng)基內(nèi)含75 mg氨基氮的比例,用蒸餾水稀釋消化液,按鼠疫基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方加入相應(yīng)試劑[2]。

2.2.3 培養(yǎng)基外觀性能控制 制備好的培養(yǎng)基應(yīng)有相應(yīng)的顏色,一般的培養(yǎng)基應(yīng)澄清、無渾濁、無沉淀。使用前應(yīng)檢查培養(yǎng)基的顏色是否發(fā)生變化,是否蒸發(fā)/脫水。

2.2.4 污染控制 從每批制備好的培養(yǎng)基中選取部分進(jìn)行污染測試(即無菌試驗(yàn)),確定無微生物生長方可使用。

2.2.5 性能測試 測試菌株是具有其代表種的穩(wěn)定特性并能有效證明實(shí)驗(yàn)室特定培養(yǎng)基最佳性能的一套菌株,菌株的選擇參考衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]。

3 制備培養(yǎng)基應(yīng)注意的事項(xiàng)

3.1 牛肉選用 在制備胰酶消化液時,牛肉的選擇尤為重要,常用牦牛肉,因其氨基氮含量高于黃牛肉。

3.2 控制溫度 消化液消化受其溫度、消化程度的影響。

3.3 用水要求 避免使用自來水,因自來水中的漂白粉、氯氣等對微生物生長有抑制作用。

3.4 化學(xué)試劑 所用化學(xué)試劑均需化學(xué)純或分析純。

3.5 稱量用具 要求專用的角匙,避免交叉污染而影響檢驗(yàn)結(jié)果。干粉培養(yǎng)基易吸潮,如有條件,盡量在溫度較低的房間稱取培養(yǎng)基。

3.6 瓊脂質(zhì)量 培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)氣候、季節(jié)的不同進(jìn)行調(diào)試,以白金環(huán)不易劃破且具有彈性為宜。

3.7 用具要求 制作培養(yǎng)基時不宜用金屬器皿。

3.8 p H值控制 鼠疫生長的最適p H值為6.9-7.1,使用過程中,如果要調(diào)整培養(yǎng)基的p H值,應(yīng)用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)整,注意不可反復(fù)調(diào)p H,否則會影響培養(yǎng)基的滲透壓。在制備培養(yǎng)基時,不要貪圖方便,使用p H試紙,特別是廣泛p H試紙,誤差太大,必須準(zhǔn)確測定,特別是含有指示劑的培養(yǎng)基,應(yīng)高出實(shí)際所用p H值0.2范圍(因高壓后p H值降低0.2),培養(yǎng)基不宜多次高壓滅菌,以免破壞其有效成分,降低p H值[4]。

3.9 滅菌處理 培養(yǎng)基配制好以后,應(yīng)立即進(jìn)行必要的滅菌處理,一般用濕熱滅菌法,即高壓蒸氣滅菌器,121℃滅菌20～30 min,某些含糖及特殊成份不耐熱的培養(yǎng)基采用115℃滅菌15～20 min。

3.10 添加劑 在制備敏感培養(yǎng)基所加入刺激劑如10%脫纖維兔溶血時,培養(yǎng)基不宜太熱,一般在45℃左右,否則,破壞其血液中的蛋白成分,使其刺激作用降低。

3.11 沉淀物觀察 培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀,若有則應(yīng)過濾,制備好的培養(yǎng)基必須及時滅菌以避免細(xì)菌繁殖;培養(yǎng)基的分裝量應(yīng)不超過容器的1/3,最終不得超過2/3,以免溢出,制好培養(yǎng)基應(yīng)存于冷暗處,但不得放置過久,在錐形瓶中最多不超過1個月,以免水分丟失和染菌,已溶化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完,開啟后不宜再用或者反復(fù)加熱溶化,溶化時不應(yīng)在電爐上直接加熱,以免營養(yǎng)成分破壞,最好以微波爐溶化。

3.12 外觀檢查 自制的培養(yǎng)基或從市場購買的培養(yǎng)基必須檢查其顏色和透明度。液體培養(yǎng)基應(yīng)清晰,若有混濁或沉淀,可能為其自身成分析出或細(xì)菌污染所致,此培養(yǎng)基不可使用;若固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)干裂,血平板出現(xiàn)溶血或有菌膜生長均不能使用;培養(yǎng)基的p H值超過規(guī)定值±0.2也不能使用。

3.13 分裝及檢驗(yàn) 各類似無菌操作分裝的培養(yǎng)基均須于35℃孵育24 h,無菌生長為合格;配制的培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后的成品,可隨機(jī)抽樣于37℃培養(yǎng)24 h,無菌生長為合格。

3.14 完整記錄 每批培養(yǎng)基均有記錄,包括培養(yǎng)基名稱、配制量、配方、配制者、原料批號、商品名、配制日期及滅菌情況等。如培養(yǎng)基出現(xiàn)質(zhì)量問題,則可通過這些資料查找原因,并保證培養(yǎng)基在有效期內(nèi)使用[4]。

4 討 論

培養(yǎng)基的質(zhì)量是鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測工作的基礎(chǔ),事關(guān)檢測工作的準(zhǔn)確性、可靠性,在微生物檢測工作中舉足輕重。如果在工作中忽視一個環(huán)節(jié)的質(zhì)量問題,都將導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果科學(xué)性、客觀性偏離。因此,加強(qiáng)培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制,認(rèn)真做好培養(yǎng)基的質(zhì)控工作,不斷完善提高培養(yǎng)基的質(zhì)控水平,才能為鼠疫檢測工作提供高質(zhì)量的培養(yǎng)基。

[1]紀(jì)樹立.鼠疫[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1988:252.

[2]席亞芳,馮建萍,金星,等.赫氏干燥培養(yǎng)基的研究和制備[J].醫(yī)學(xué)動物防治,2006,22(10):719-720.

[3]張朝武,唐偉,黃升海,細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:14-15.

[4]梁冰,李慧,吳振軍,等.微生物學(xué)檢驗(yàn)分冊[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2006:433-434.

1002-2694(2011)08-0761-02

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A

馮建萍,Email:fjp6286350@163.com

青海省地方病預(yù)防控制所,西寧 811602

2010-12-06;

2011-03-18