操 敏,王忠燦,陸年紅,黃華東,郭恒彬,王長(zhǎng)軍,張 興,唐家琪

2.解放軍73046部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì),三界 239421

安徽三界地區(qū)嚙齒動(dòng)物感染恙蟲(chóng)病東方體調(diào)查*

操 敏1,王忠燦1,陸年紅1,黃華東2,郭恒彬1,王長(zhǎng)軍1,張 興1,唐家琪1

目的調(diào)查安徽三界地區(qū)嚙齒動(dòng)物自然感染恙蟲(chóng)病東方體分離株,并確定其基因型別。方法流行季節(jié)在野外用鼠籠捕鼠并鑒定鼠種、攜螨率;巢式PCR對(duì)鼠臟器進(jìn)行恙蟲(chóng)病東方體56 kD基因片段檢測(cè);將鼠臟器接種小白鼠進(jìn)行病原體分離,PCR擴(kuò)增分離株Ot 56 kD基因片段,并將目的片段進(jìn)行測(cè)序,基因序列同源性及進(jìn)化分析。結(jié)果捕獲嚙齒動(dòng)物數(shù)及其攜螨率,黑線姬鼠60%(15/25);褐家鼠45.5%(5/11);東方田鼠和鼩鼱各2只,均陰性。40只野鼠臟器有 3只恙蟲(chóng)病東方體PCR擴(kuò)增陽(yáng)性,陽(yáng)性率為7.5%;從黑線姬鼠標(biāo)本中分離到1株恙蟲(chóng)病東方體Sanjie,56 kD基因片段測(cè)定該株與臺(tái)灣TT0711a和N T0511b分離株同源性最高(98%),系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析也顯示與Kawasaki型共處于同一分支。結(jié)論安徽三界地區(qū)存在鼠類恙蟲(chóng)病東方體自然感染,黑線姬鼠為其主要宿主,當(dāng)?shù)仨οx(chóng)病東方體屬Kawasaki基因型。

恙蟲(chóng)病東方體;嚙齒動(dòng)物;病原分離;分子流行病學(xué)

三界地區(qū)位于安徽省東北部邊緣,地處江淮分水嶺地帶,屬低山丘陵地形。2007年11月當(dāng)?shù)伛v軍某部發(fā)生一起恙蟲(chóng)病暴發(fā)流行[1],僅1個(gè)連隊(duì)1 w內(nèi)就出現(xiàn)19例臨床癥狀典型的恙蟲(chóng)病病例。嚴(yán)重威脅著廣大指戰(zhàn)員及駐地群眾的健康。當(dāng)?shù)刂盁o(wú)恙蟲(chóng)病病例及流行報(bào)告,特對(duì)三界地區(qū)嚙齒動(dòng)物自然感染恙蟲(chóng)病進(jìn)行調(diào)查,并鑒定病原體分離株的基因型別,為防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 地理、氣候、植被等項(xiàng)調(diào)查 對(duì)氣象局、環(huán)保局、林業(yè)局等機(jī)關(guān)的資料及縣志進(jìn)行查詢與現(xiàn)場(chǎng)查看相結(jié)合。

1.2 宿主動(dòng)物的調(diào)查 自2009年10～11月在三界地區(qū)不同景觀如房舍旁、菜地、花生地、草叢、田埂邊等鼠類較多區(qū)域布鼠籠捕鼠,黃昏放置晨起收回,鑒定鼠種,確定優(yōu)勢(shì)鼠種,無(wú)菌操作取肝、脾、腎臟。收集體表寄生物,計(jì)算鼠攜螨率。

1.3 巢式PCR法檢測(cè)鼠臟器標(biāo)本恙蟲(chóng)病東方體DNA 使用INVITROGEN DNA提取試劑盒提取鼠臟器DNA作為模板,引物設(shè)計(jì)針對(duì)恙蟲(chóng)病東方體56 kD主要表面抗原基因,巢式PCR檢測(cè)可提高檢測(cè)靈敏度和特異性。第一輪PCR反應(yīng)引物 P1:5′-TACAT TAGCTGCGGGTA TGACA-3＇,P2:5′-CCAGCATAATTCT TCAACCAAG-3＇,預(yù)計(jì)擴(kuò)增約340bp基因片段;第二輪 PCR反應(yīng)引物P3:5′-TAGAGCAGAGCTAGGTGTTA TGTA-3＇,P4:5′-TAGGCAT TATAGTAGGCTGAGG-3＇,預(yù)計(jì)擴(kuò)增約 180bp基因片段。反應(yīng)程序?yàn)?95℃變性 5 min,94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃1 min,35個(gè)循環(huán),72℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),PCR試劑盒購(gòu)置TAKARA公司。

1.4 恙蟲(chóng)病東方體的分離與鑒定

1.4.1 恙蟲(chóng)病東方體的分離 2009年10～11月從三界地區(qū)野外草叢、花生地、田埂等生境捕鼠,無(wú)菌操作取肝、脾、腎臟按同日同生境同種鼠2～6只為1份,共7份,包括黑線姬鼠3份,褐家鼠2份,東方田鼠和鼩鼱各1份。以上標(biāo)本分別添加SPG蔗糖磷酸緩沖液,制成10%懸液,經(jīng)腹腔接種15～18g昆明種小白鼠4只/組,0.5mL/只,每天觀察2次。陰、陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。判定為分離恙蟲(chóng)病東方體陽(yáng)性的小白鼠,無(wú)菌取肝、脾、腎置-30℃,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR鑒定 按常規(guī)方法從恙蟲(chóng)病東方體陽(yáng)性感染的小白鼠臟器中提取DNA作為模板。用上述巢式PCR鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.3 序列測(cè)定及分析 將擴(kuò)增的基因片段送至TAKARA公司測(cè)序。同時(shí)遞交GENBANK獲序列號(hào)為:JF04210。測(cè)得的序列BLAST,用Bioedit軟件將序列長(zhǎng)度編輯一致并進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換后,用clustal X軟件與各參考株序列進(jìn)行多重排列、比較和同源性分析,軟件Mega 4.0中Distances程序計(jì)算一組序列內(nèi)及組間基因進(jìn)化距離(Evolutionary distances),利用最短進(jìn)化長(zhǎng)度算法(minimal evolution)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 丘陵平原地形 三界地區(qū)位于安徽省東北部邊緣,地處江淮分水嶺丘陵地帶,屬低山丘陵地形,北緯32°47′,東經(jīng)117°58′。屬于北亞熱帶與溫暖帶過(guò)渡地帶的半濕潤(rùn)氣候,年平均氣溫15℃,無(wú)霜期219 d,十分適宜花生、山芋等作物種植。其它種植作物主要有水稻、小麥、油菜、芝麻、玉米、小煙等。植被較豐富,適于恙螨、嚙齒動(dòng)物等孳生。

2.2 鼠類宿主及其攜螨率 2009年10～11月在三界地區(qū)捕獲嚙齒動(dòng)物40只,包括黑線姬鼠25只,褐家鼠11只,東方田鼠2只,鼩鼱2只,以黑線姬鼠為優(yōu)勢(shì)鼠種,占62.5%。黑線姬鼠,褐家鼠,攜螨率分別是60%(15/25)、45.5%(5/11)。東方田鼠,鼩鼱均陰性。

2.3 分子流行病學(xué)檢測(cè) 套式PCR法檢測(cè)40只野鼠,結(jié)果從3只黑線姬鼠體內(nèi)擴(kuò)增出約200 bp基因片段,見(jiàn)圖1。a,b,c,與預(yù)計(jì)目的基因片段大小相符。PCR擴(kuò)增陽(yáng)性率為7.5%。

圖1 鼠脾中Ot特異性片斷擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(a-c:野鼠脾PCR產(chǎn)物;d:接種小鼠脾PCR產(chǎn)物;M:1kb marker)Fig.1 The electrophoresis results of PCR products from the spleen of rodents and micea-c:PCR products from the spleen of rodents;d:PCR products from the spleen of inoculated mice;M:1kb marker.

2.4 東方體的分離與鑒定

2.4.1 東方體的分離 用7份鼠臟器標(biāo)本(黑線姬鼠3份,褐家鼠2份,東方田鼠和鼩鼱各1份)分別接種小鼠,結(jié)果僅1份黑線姬鼠臟器接種小鼠出現(xiàn)典型東方體感染癥狀(如聳毛,弓背,厭食,腹部增大),腹壁刮液姬姆薩染色光鏡下見(jiàn)紫紅色東方體顆粒,見(jiàn)圖2。

2.4.2 PCR鑒定 將該小鼠提取臟器DNA做模板,用恙蟲(chóng)病東方體特異的套式PCR擴(kuò)增,獲得約200 bp的基因片段。

2.4.3 序列測(cè)定 將該基因片段測(cè)序(序列已遞交GenBank,列號(hào):JF04210),序列 BLAST顯示該株?yáng)|方體與臺(tái)灣T T0711a株和NT0511b同源性最高為98%。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析也顯示,Sanjie和TT0711a,NT0511b在同一分支,它們又與Kawasaki型共處于同一分支。見(jiàn)表1與圖3。

圖 2 Ot感染小白鼠腹壁刮液 Giemsa涂片F(xiàn)ig.2 Giemsasmearoftheperitonealcellsofot infectious mice

表1 17株恙蟲(chóng)病東方體sta 56基因的進(jìn)化距離及其標(biāo)準(zhǔn)差Table 1 Evolutionary distances between 56 kD gene sequences of 17 strains of O.tsutsugamushi

圖3 17株恙蟲(chóng)病東方體sta 56基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of O.tsutsugamushi strains constructed based on nucleotide sequence of sta 56

3 討 論

近年來(lái),我國(guó)恙蟲(chóng)病病例斷續(xù)發(fā)生。此與經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和砍伐森林、興修水利、筑路、旅游等開(kāi)發(fā)自然資源的行為的增多、與自然疫源地的接觸密切,從而導(dǎo)致病例不斷增多。1985年以前我國(guó)恙蟲(chóng)病僅流行在北緯31°以南的廣大地區(qū),1986年后長(zhǎng)江以北的山東、江蘇、山西、河北、天津等地相繼發(fā)生恙蟲(chóng)病流行[3-5]。迄今,我國(guó)已報(bào)導(dǎo)有22個(gè)省區(qū)均有該病的發(fā)生和流行。

恙蟲(chóng)病在安徽省屬于新發(fā)傳染病。歷史上僅休寧1982年報(bào)告1例病例[7],接下來(lái)25年無(wú)病例報(bào)告,直到2007年11月,安徽三界地區(qū)某部駐軍出現(xiàn)一起恙蟲(chóng)病暴發(fā)流行[2],之后,恙蟲(chóng)病在安徽省呈高發(fā)態(tài)勢(shì)。2008年阜陽(yáng)出現(xiàn)恙蟲(chóng)病暴發(fā)流行[8],病例78例,同年,蚌埠也出現(xiàn)數(shù)十例恙蟲(chóng)病病例,2009年,阜陽(yáng)再次出現(xiàn)恙蟲(chóng)病暴發(fā)疫情,三界地區(qū)近幾年也時(shí)有散在病例發(fā)生。這提示安徽省存在恙蟲(chóng)病疫源地。安徽省的恙蟲(chóng)病疫情均發(fā)生在10～11月,為秋季型恙蟲(chóng)病。迄今,長(zhǎng)江以北地區(qū)所報(bào)告病例均屬秋冬型。目前該省恙蟲(chóng)病疫源地調(diào)查工作鮮有報(bào)道,病原分離等工作尚屬空白。劉紅等[9]通過(guò)對(duì)安徽廣德、明光和懷遠(yuǎn)3縣農(nóng)村613份人群血清感染恙蟲(chóng)病抗體水平的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),3地以明光市恙蟲(chóng)病血清陽(yáng)性率最高,達(dá) 71.50%;廣德縣較低,為15.50%。家畜血清恙蟲(chóng)病陽(yáng)性率也以明光市最高,達(dá)80.39%,懷遠(yuǎn)縣最低,為2.08%。三界地區(qū)位于明光境內(nèi),是部隊(duì)駐地,當(dāng)?shù)刂脖回S富,適合嚙齒動(dòng)物及螨類孳生,為丘陵平原型疫源地。秋季野外嚙齒動(dòng)物種類主要是黑線姬鼠、東方田鼠和鼩鼱,農(nóng)舍室內(nèi)為褐家鼠,以黑線姬鼠為優(yōu)勢(shì)鼠種,為主要宿主。此次從黑線姬鼠體分離到一株?yáng)|方體,為安徽省首次報(bào)告分離的地方株。在中國(guó),恙蟲(chóng)病東方體的基因型別主要以Gilliam、Karp和Kawasaki型為主。在長(zhǎng)江以南地區(qū)主要表現(xiàn)為Gilliam和Karp型[10-11]。長(zhǎng)江以北地區(qū)分離株主要為Kawasaki和Gilliam型[12-13]。本研究對(duì)東方體56 kD序列分析結(jié)果顯示,與臺(tái)灣TT0711a和NT0511b株同源性最高為98%,進(jìn)化距離最短為0.066,在進(jìn)化樹(shù)上,它與Kawasaki在同一分支,提示三界地區(qū)恙蟲(chóng)病東方體分離株屬Kawasaki型,這與地理位置較近的江蘇和山東省報(bào)道的東方體基因型相似。

[1]汪茂榮,于樂(lè)成,何長(zhǎng)倫,等.安徽地區(qū)一起恙蟲(chóng)病暴發(fā)流行的調(diào)查分析[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志,2008,2(3):174-177.

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Investigation on rodents infection ofOrientia tsutsugamushiin Sanjie,an area of An Hui province,China

CAO Min,WANG Zhong-can,LU Nian-hong,HUANG Hua-dong,GUO Heng-bin,WANG Chang-jun,ZHANG Xing,TANG Jia-qi
(Centers for Disease Control and Prevention of Nanjing Command,Nanjing,210002China)

The purpose of this study was to investigate the rodents infection ofOrientiatsutsugamushiand determine the genetype of theOtstrain in Sanjie,anhui province.In epidemic season,the rodents were capturied and the mites were collected in the field,then the dominant kind of rodents were determined after classifying and calculating them.The DNA of 40 rodent spleens were detected by PCR;The mice were peritoneal injected by the homogenized spleen of rodents to isolateorientia tsutsugamushiin this region.The partial gene ofOt56 kD outmembrane protein was amplified from the spleen of infectious mice and sequneced.Phylogenetic tree was constructed on the 56 kD gene of 17 strains.The results showed that the captured rodents and the rates of carrying mite were Apodemus agrarius 25,60%(15/25);Rattus norvegicus 11,45.5%(5/11),Microtus fortis 2 and S.inutus Linnaeus with negative carrying mite rate respectively;The DNA of 3 spleen of rodents were positive by PCR usingOtspecific primers.OneOtstrain named Sanjie was isolated from Apodemus agrarius.The gene sequence of Sanjie 56kD protein showed 98%homology with T T0711a and NT0511b strans isolated from Taiwan.Phylogenetic analysis showed that Sanjie was in the same branch with T T0711a and NT0511b,and the three were also in the same branch with kawasaki strain.This study indicated thatOtinfection was presented in rodents from Sanjie and Apodemus agrarius was the main host.The genotype of Sanjie was determined as Kawasaki type.

scrub typhus;rodent;Orientia tsutsugamushi;pathogen isolation;molecular epidemiology

R376

A

1002-2694(2011)08-0721-03

*南京軍區(qū)南京軍區(qū)重點(diǎn)科研項(xiàng)目(08Z034)和2010年度南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題(10MA129)聯(lián)合資助

操敏,Email:anniecao2001@yahoo.com

1.南京軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心,南京 210002;

2.解放軍73046部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì),三界 239421

2011-04-22;

2011-06-27