朱克鵬 綜述 楊光倫 涂剛 審校

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，重慶 400016

內(nèi)分泌治療是乳腺癌患者綜 合治療的重要組成部分，他莫昔芬(tam oxifen，TAM)屬于選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogen receptor modulator，SE RM)類(lèi)藥物，是目前最基礎(chǔ)、有效，且運(yùn)用歷史最悠久的一線內(nèi)分泌治療藥物，但一旦發(fā)生耐藥，TAM反而會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。所以長(zhǎng)期應(yīng)用TAM的繼發(fā)性耐藥限制了其臨床應(yīng)用。因此，研究?jī)?nèi)分泌治療的耐藥機(jī)制，同時(shí)尋找克服治療耐藥的方法，進(jìn)而開(kāi)發(fā)相關(guān)抗耐藥藥物有著重要的臨床意義。

G蛋白偶聯(lián)受體-30(G protein-coupled receptor 30，GPR30)是一種新型具有獨(dú)立作用的膜性結(jié)合性雌激素受體(estrogen receptor，ER)，介導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和ER等重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等行為。GPR30的激活可能導(dǎo)致了TAM耐藥性的發(fā)生。本文從GPR30的作用機(jī)制和TAM的耐藥性機(jī)制聯(lián)系為出發(fā)點(diǎn)，探討GPR30在TAM耐藥性中的作用。

1 GPR30及其與EGFR、ERα的關(guān)系

1.1 GPR30的發(fā)現(xiàn)、功能及亞細(xì)胞定位

經(jīng)典理論認(rèn)為，雌激素通過(guò)細(xì)胞內(nèi)兩種核受體ERα、ERβ調(diào)控轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但二者并不足以完成雌激素的全部作用。GPR30為一類(lèi)由375個(gè)氨基酸殘基組成的7 次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)，1997年Carmeci等［1］在不同細(xì)胞中克隆得到GPR30。2005年，Thomas等［2］和Revankar等［3］均證實(shí)其可特異性地與雌激素結(jié)合，與17β-estradiol(E2)的結(jié)合模式與經(jīng)典的ERα、ERβ均不同，且與二者沒(méi)有同源性，因此被視為一種具有獨(dú)立作用的新型ER。

GPR30與雌激素結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)移，cAMP增加，在細(xì)胞核內(nèi)合成三磷酸磷脂酰肌醇［phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphate］。其參與介導(dǎo)了雌激素快速非基因組效應(yīng)及基因組轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織生長(zhǎng)。GPR30可能參與抑制ERα(+)乳腺癌增殖［4］、SERM的耐藥過(guò)程［5］，并參與一些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷徙及轉(zhuǎn)移等。

GPR30的亞細(xì)胞定位存在爭(zhēng)議［6］。Thomas等［2］及Filardo等［7］認(rèn)為GPR30在細(xì)胞膜上結(jié)合配體發(fā)揮相關(guān)病理生理作用。近來(lái)研究證實(shí)GPR30亦可能定位于細(xì)胞內(nèi)，Gβ、Gγ亞單位合成后定向轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)與Gα亞單位結(jié)合形成GPR30，在適當(dāng)?shù)臈l件下，胞內(nèi)GPR30可能向細(xì)胞表面易位。研究者在共聚焦熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的GPR30主要聚集在乳腺癌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，熒光標(biāo)記的雌二醇(E2-Alexa 546和E2-Alexa 633)同GPR30-GFP共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，細(xì)胞膜外未發(fā)現(xiàn)結(jié)合位點(diǎn)［3，8］。Funakoshi等［9］研究發(fā)現(xiàn)，GPR30位于HeLa細(xì)胞及海馬CA2錐體細(xì)胞的細(xì)胞膜，但在雌激素的作用下可以“轉(zhuǎn)位”到細(xì)胞質(zhì)。Cheng等［10］發(fā)現(xiàn)GPR30聚集于細(xì)胞核周?chē)adeo等［11］發(fā)現(xiàn)GPR30定位于細(xì)胞核內(nèi)，介導(dǎo)E2誘導(dǎo)乳腺癌相關(guān)蛋白(CAF)的增殖和轉(zhuǎn)移。因此，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為GPR30是一種膜性結(jié)合性ER，然而較難定位GPR30位置及功能，因?yàn)槠涫芗?xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞內(nèi)外因素影響［6］。

1.2 GPR30的生理與病理作用

E2、G-1、4-羥他莫昔芬(4-hydroxtamoxifen，OHT)及環(huán)境雌激素等配體與GPR30結(jié)合后可轉(zhuǎn)活EGFR、上調(diào)cAMP和Ca2+，激活相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終在各雌激素敏感器官產(chǎn)生細(xì)胞增殖等相關(guān)反應(yīng)。Filardo等［12］通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)321例原發(fā)性乳腺癌患者的ER、PR和GPER，發(fā)現(xiàn)GPR30與ER共同表達(dá)的比例為43%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GPR30過(guò)表達(dá)與Her-2過(guò)表達(dá)、腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示其是乳腺癌生物學(xué)進(jìn)展的指標(biāo)之一。但Kuo等［13］在118例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中發(fā)現(xiàn)GPR30 mRNA的表達(dá)與Her-2并無(wú)相關(guān)性。且無(wú)論在基因或蛋白水平，GPR30的表達(dá)與患者的年齡及腫瘤的大小、分級(jí)、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴血管侵襲均無(wú)相關(guān)性，證實(shí)其不是影響患者生存率的一個(gè)獨(dú)立因子。Arias-Pulido等［14］在炎性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)GPR30的表達(dá)率為69%，而GPR30與ER的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與PR、Her-2及EGFR的表達(dá)無(wú)相關(guān)性。GPR30與患者總生存率(overall survival，OS)或無(wú)病生存率(disease free survival，DFS)無(wú)關(guān)，然而GPR30、ER共表達(dá)可提高OS并輕微提高DFS，二者均不表達(dá)的患者OS和DFS較差,這與之前的結(jié)果相反［15-16］。Pandey等［17］研究發(fā)現(xiàn)GPR30結(jié)合E2、OHT可以使CTGF表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。E2、OHT還可通過(guò)GPR30刺激甲狀腺、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖［18-20］。Quinn等［21］證實(shí)E2與氟為司瓊(ICI182780)均可通過(guò)GPR30，在整合蛋白(integrin)、Shc、Src樣激酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)參與下，增強(qiáng)纖維連接蛋白基質(zhì)組裝形成原纖維，促進(jìn)細(xì)胞黏附、播撒和生存，提示ER拮抗劑可能通過(guò)GPR30促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)GPR30參與鎘誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖，揭示鎘與GPR30的結(jié)合位點(diǎn)及信號(hào)級(jí)聯(lián)過(guò)程中相關(guān)事件的研究正在進(jìn)行中［22］。

1.3 GPR30與EGFR及ERα的關(guān)系

GPR30是獨(dú)立于ERα、ERβ的新型雌激素膜性受體，可通過(guò)反式激活EGFR，介導(dǎo)E2增殖效應(yīng)，參與乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移行為［23］，并且TAM及代謝產(chǎn)物OHT是其激動(dòng)劑，因此可能在TAM耐藥中發(fā)揮重要作用。大量研究認(rèn)為GPR30的生物學(xué)效應(yīng)與EGFR、MAPK/ERK、PI3K/AKT、cAMP等信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)系密切［6，23-27］，有著密切的互動(dòng)聯(lián)系(cross-talk)或存在正反饋回路。Prossnitz等［24-25］證實(shí)，E2、OHT等配體與GPR30結(jié)合，使G蛋白異三聚體解體，Gβ、Gγ通過(guò)百日咳毒素敏感途徑激活Src磷酸化，后者激活細(xì)胞膜表面的MMP，導(dǎo)致肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)的釋放，HB-EGF作為EGFR的配體與EGFR結(jié)合，激活其下游信號(hào)通路，包括促分裂活化因子磷酸化蛋白激酶(MAPK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、PI3K，增加c-fos等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和延長(zhǎng)細(xì)胞周期進(jìn)展。Filardo等［26］研究發(fā)現(xiàn)在表達(dá)GPR30的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中雌激素可以級(jí)聯(lián)激活MAPK/ERK途徑。而在不表達(dá)GPR30的乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞系則不能激活該途徑，但MDA-MB231細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染GPR30 后可恢復(fù)該途徑激活，從而證實(shí)了GPR30介導(dǎo)MAPK/ERK信號(hào)途徑的重要性。Albanito等［27］在SKBR3乳腺癌細(xì)胞中證實(shí)EGF活化EGFR信號(hào)上調(diào)GPR30的表達(dá)，EGF激發(fā)了一個(gè)GPR30介導(dǎo)參與的正反饋環(huán)形通路，介導(dǎo)E2增殖效應(yīng)，增強(qiáng)了EGFR信號(hào)作用。

在多種癌組織、胰腺、骨、睪丸及血管內(nèi)皮等組織細(xì)胞中，GPR30和ER有協(xié)同作用［28］。Albanito等［20］在ERα(+)BG-1卵巢癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，E2或G-1誘導(dǎo)c-fos表達(dá)，激發(fā)GPR30、ERα表達(dá)，活化ERK。抑制EGFR轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可抑制上述通路，提示GPR30/EGFR信號(hào)依賴(lài)ERα表達(dá)程度。認(rèn)為GPR30和ERα運(yùn)用同一條EGFR信號(hào)途徑，參與E2、G-1共同刺激卵巢癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。Huang等［29］用免疫組化證實(shí)在子宮癌肉瘤中，GPR30和ERβ協(xié)同過(guò)表達(dá)，在進(jìn)展期疾病中二者表達(dá)水平增高。GPR30和ERβ表達(dá)與ERα及PR無(wú)相關(guān)性。Sirianni等［30］證實(shí)在鼠GC-1精原細(xì)胞中，E2、G-1均可激活ERK，上調(diào)c-fos的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而ERα拮抗劑ICI、EGFR抑制劑、ERK抑制劑以及GPR30基因沉默都可消除相關(guān)效應(yīng)，說(shuō)明ERα、GPR30之間存在“交談”，通過(guò)EGFR/ERK/c-fos途徑介導(dǎo)上述反應(yīng)。Gao等［31］發(fā)現(xiàn)GPR30抑制ERK1/2和ERα磷酸化信號(hào)，拮抗雌激素依賴(lài)性子宮的發(fā)育。

2 TAM的藥理作用機(jī)制及相關(guān)耐藥機(jī)制

2.1 TAM的藥理作用機(jī)制

TAM為非甾體類(lèi)抗雌激素藥物，結(jié)構(gòu)與雌激素相似，存在Z型和E型兩個(gè)異構(gòu)體。TAM進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與ER競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，形成受體復(fù)合物，引起ER構(gòu)象改變，阻止雌激素活性的發(fā)揮，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

然而，對(duì)TAM敏感的ER陽(yáng)性患者在用藥過(guò)程中仍有1/3發(fā)生TAM耐藥。研究發(fā)現(xiàn)ER與Her-2信號(hào)通路之間的“交談”是TAM耐藥的一個(gè)重要原因［32］，但這并不能完全解釋TAM的耐藥性機(jī)制，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)GPR30可能是引起TAM耐藥的另一始動(dòng)因素。GPR30在TAM耐藥中的作用是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。

2.2 TAM的相關(guān)耐藥機(jī)制

對(duì)于不同的基因和細(xì)胞環(huán)境，TAM起著部分激動(dòng)劑/拮抗劑或完全激動(dòng)劑作用。TAM治療的乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，實(shí)際是促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。目前乳腺癌細(xì)胞在TAM治療過(guò)程中發(fā)生耐藥的生物學(xué)機(jī)制并不完全清楚，Riggins等［33］認(rèn)為T(mén)AM的先天和獲得性耐藥與多種機(jī)制相關(guān)，主要包括：⑴與ERα的表達(dá)、下調(diào)，ERα突變，ER磷酸化有關(guān)；⑵與EGFR/ Her-2、ERK1/2、PI3K/AKT、IGF-1R等信號(hào)通路的活化有關(guān)；⑶與Cas、c-Scr、BCAR3等分子過(guò)表達(dá)有關(guān)。

相關(guān)研究證實(shí)，EGFR和(或)Her-2過(guò)表達(dá)，活化MAPK通路參與促進(jìn)TAM耐藥性的產(chǎn)生［37］。ER與各生長(zhǎng)因子信號(hào)通路之間的“交談”是TAM產(chǎn)生耐藥的另一個(gè)重要原因［35］。多種機(jī)制可下調(diào)ER途徑的各種成分，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤增殖、分化，其中最重要的是EGFR/Her-2途徑［36］。Her-2在乳腺癌中的耐藥是通過(guò)激活顯性負(fù)抑制酪氨酸激酶(Akt)或MAPK完成的，這些激酶可以使ER磷酸化，Her-2與ER間的這種相互作用，可能導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM產(chǎn)生耐藥。Leary等［37］研究證實(shí)在內(nèi)分泌治療獲得耐藥的細(xì)胞模型中Her-2表達(dá)上調(diào)，而Her-2抑制劑拉帕替尼(lapatinib)可恢復(fù)內(nèi)分泌系統(tǒng)的敏感性，在經(jīng)TAM處理的ERα活性降低的細(xì)胞模型中，拉帕替尼可恢復(fù)ERα的基因活性功能，提高TAM療效，這種效應(yīng)取決于ERα/Her-2的“交談”特點(diǎn)，提示ERα/Her-2可能在乳腺癌患者TAM耐藥中起重要作用。Creighton等［38］通過(guò)建立乳腺癌(MCF-7)體內(nèi)模型，揭示在TAM耐藥乳腺癌中，通過(guò)ER突變或生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑，一定程度上再活化雌激素信號(hào)途徑產(chǎn)生耐藥。上述細(xì)胞系活化EGFR及Her-2信號(hào)途徑產(chǎn)生耐藥。當(dāng)運(yùn)用Her-2抑制劑吉非替尼(gefitinib)和氟為司瓊時(shí)，發(fā)生TAM耐藥時(shí)間明顯推遲。TAM和吉非替尼可阻止Her-2途徑，恢復(fù)TAM的抗腫瘤效應(yīng)。這提示EGFR/Her-2和ER信號(hào)通路在ER陽(yáng)性乳腺癌患者TAM耐藥中起重要作用。

3 GPR30在TAM中的耐藥性機(jī)制

隨著對(duì)乳腺癌內(nèi)分泌治療研究的愈加深入，發(fā)現(xiàn)約30%的ER和PR陽(yáng)性的患者對(duì)TAM治療不敏感或無(wú)效，這意味著阻斷ER相關(guān)信號(hào)通路并不能完全抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。E2、TAM及代謝產(chǎn)物OHT和ICI182780均能激活GPR30，OHT對(duì)ICI182780、ERα是完全或不完全的拮抗劑，而對(duì)GPR30則是激動(dòng)劑，能促進(jìn)GPR30反式激活EGFR信號(hào)途徑，從而導(dǎo)致上述藥物耐藥性的產(chǎn)生。

Ignatov等［39］第一次證實(shí)了GPR30在TAM-R乳腺癌細(xì)胞中的耐藥性機(jī)制。用TAM長(zhǎng)期處理MCF-7細(xì)胞增強(qiáng)其對(duì)E2的敏感性，上調(diào)GPR30表達(dá)，使GPR30從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位至細(xì)胞表面，此時(shí)TAM被轉(zhuǎn)變成促生長(zhǎng)激動(dòng)劑。GPR30活化c-Src、MMPs，繼而激活EGFR信號(hào)，下游的MAPK和AKT磷酸化促進(jìn)包括ER在內(nèi)的多種基因的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖。而磷酸化的ER進(jìn)一步上調(diào)GPR30，從而建立一個(gè)惡性循環(huán)周期，導(dǎo)致TAM耐藥性的產(chǎn)生。GPR30上調(diào)可增加TAM-R細(xì)胞對(duì)G-1的敏感性，并促進(jìn)耐藥性的發(fā)展。經(jīng)G-1處理的MCF-7細(xì)胞，TAM增強(qiáng)MAPK磷酸化，當(dāng)敲除GPR30，抑制EGFR信號(hào)時(shí)，可恢復(fù)TAM的生物效應(yīng)。證實(shí)了GPR30 /MAPK信號(hào)串聯(lián)在體外TAM耐藥性形成中的重要作用。Mojarrad等［40］通過(guò)建立的細(xì)胞模型證實(shí)，自分泌人類(lèi)生長(zhǎng)激素(human growth hormone，HGH)上調(diào)GPR30的表達(dá)，增加細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞TAM耐藥。Vivacqua等［41］揭示在TAM耐藥細(xì)胞中，EGF和TGFα活化EGFR/ERK信號(hào)通路，反式激活GPR30，上調(diào)mRNA、蛋白的表達(dá)。誘使c-fos結(jié)合活化蛋白1(activating protein 1，AP-1)位點(diǎn)，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性，參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲和生存。GPR30與EGFR、ERα之間存在著豐富的互動(dòng)聯(lián)系，導(dǎo)致TAM耐藥性的產(chǎn)生，最重要的是TAM能結(jié)合并活化GPR30。Kleuser等［42］認(rèn)為E2和ICI182780均可通過(guò)GPR30抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β信號(hào)通路，導(dǎo)致乳腺癌患者內(nèi)分泌治療耐藥。Ignatov等［43］比較了95例接受TAM或其他輔助治療的乳腺癌患者子宮內(nèi)膜組織中GPR30的表達(dá)類(lèi)型發(fā)現(xiàn)，在體外TAM通過(guò)GPR30刺激MAPK磷酸化和子宮內(nèi)膜細(xì)胞系的細(xì)胞增殖，在體內(nèi)GPR30表達(dá)水平與TAM誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜病理相關(guān)，而且GPR30可預(yù)測(cè)疾病的早期發(fā)展癥狀并誘導(dǎo)TAM治療，從而證實(shí)GPR30在TAM誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。Albanito等［20］認(rèn)為GPR30與ERα在內(nèi)分泌治療耐藥和雌激素敏感性腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，運(yùn)用同一條EGFR信號(hào)通路。國(guó)內(nèi)外一些相關(guān)的耐藥性機(jī)制研究也正在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，相信隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展會(huì)更加全面的揭示GPR30在TAM耐藥性中的發(fā)生機(jī)制，作為新的靶向目標(biāo)為開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療抗腫瘤藥物提供機(jī)遇［44-45］。

4 小結(jié)

盡管人類(lèi)GPR30與鼠GPR30約有87%相似性，在功能和病理學(xué)上仍存在13%差異，GPR30具體是否是雌激素受體，體內(nèi)作用如何，能否結(jié)合雌二醇及其亞細(xì)胞定位均存在爭(zhēng)議。

我們認(rèn)為利用G-1［46］、G-15［47］、E3［48］能進(jìn)一步揭示體內(nèi)GPR30機(jī)制、細(xì)胞和生理及生物學(xué)功能等，開(kāi)啟針對(duì) GPR30相關(guān)疾病的診斷和治療。E2、OHT和ICI18278做為GPR30激動(dòng)劑，對(duì)GPR30活化信號(hào)通路和誘使TAM產(chǎn)生耐藥的機(jī)制的深入研究，將為開(kāi)發(fā)拮抗GPR30和經(jīng)典ER途徑的藥物提供新的平臺(tái)。

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