蔡增苗 林昭靜 任富亮

（中國醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)七年制，遼寧 沈陽 110001）

脂肪干細(xì)胞在軟骨組織工程中的應(yīng)用

蔡增苗 林昭靜 任富亮

（中國醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)七年制，遼寧 沈陽 110001）

軟骨組織工程的興起為軟骨缺損的修復(fù)重建提供了新的治療途徑，但是由于缺乏合適的種子細(xì)胞，發(fā)展相對(duì)緩慢。脂肪干細(xì)胞來源廣，含量豐富，創(chuàng)傷小，有望成為理想的種子細(xì)胞。本文就脂肪干細(xì)胞軟骨誘導(dǎo)的幾種方法做一綜述，希望為以后脂肪干細(xì)胞在軟骨組織工程的應(yīng)用和發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

脂肪干細(xì)胞；軟骨組織工程；軟骨誘導(dǎo)

軟骨組織缺乏血管和神經(jīng)，軟骨細(xì)胞主要靠關(guān)節(jié)滑液及細(xì)胞周圍的基質(zhì)供給營養(yǎng)，其自身修復(fù)能力相當(dāng)有限。軟骨缺損和軟骨退行性改變一直是醫(yī)學(xué)面臨的挑戰(zhàn)之一。自體軟骨移植供區(qū)有限，損傷大，異體軟骨移植存在強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。軟骨組織工程為軟骨缺損的修復(fù)重建提供了新的治療途徑。

1 種子細(xì)胞

軟骨是最早應(yīng)用組織工程技術(shù)成功構(gòu)建的組織之一，但是目前軟骨組織工程的發(fā)展卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于骨和皮膚，主要原因就是缺乏合適的種子細(xì)胞。理想的軟骨種子細(xì)胞應(yīng)具有以下特點(diǎn)：①取材方便，對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷小；②植入受體后對(duì)機(jī)體免疫排斥反應(yīng)小；③在體外培養(yǎng)時(shí)有較強(qiáng)的增殖能力；④能穩(wěn)定保持軟骨細(xì)胞表型[1]。

1.1 軟骨細(xì)胞

軟骨細(xì)胞是最早應(yīng)用的軟骨組織工程種子細(xì)胞，但是軟骨細(xì)胞來源有限，取材過程對(duì)供體損傷大，而且是終末細(xì)胞，增殖能力較弱，體外培養(yǎng)三代以上就會(huì)出現(xiàn)去分化現(xiàn)象[2]，喪失成軟骨能力，軟骨細(xì)胞移植后軟骨下骨通常得不到有效修復(fù)，移植物與軟骨下骨間的愈合不良常導(dǎo)致移植物脫落或退變。因此軟骨細(xì)胞不是理想的種子細(xì)胞。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）能夠自我繁殖，具有多向分化潛能，能夠定向誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞，且隨細(xì)胞的擴(kuò)增，細(xì)胞的性狀和分化保持不變，是較理想的種子細(xì)胞。但是MSC表達(dá)多種表面標(biāo)志物，目前還沒有一個(gè)特異性的表面標(biāo)志物，因此MSC的分離鑒定比較困難。而且取材困難、給病人帶來的痛苦大，加之骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞含量非常少，上述不足限制了MSC的應(yīng)用。

1.3 脂肪干細(xì)胞

2001年，Zuk等發(fā)現(xiàn)脂肪抽吸物中存在具有多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞，并首次命名為脂肪干細(xì)胞（ADSC）。以后的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ADSC貼壁能力強(qiáng)，對(duì)培養(yǎng)基的營養(yǎng)需求低，對(duì)血清無特殊選擇性，體外易于培養(yǎng)，體外倍增速度快于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，而且傳代過程中，細(xì)胞增殖能力穩(wěn)定。另外，ADSC來源于脂肪組織，來源廣，含量豐富，提取過程簡單，創(chuàng)傷小，有望成為理想的種子細(xì)胞。

2 脂肪干細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織的應(yīng)用現(xiàn)狀

軟骨的形成是基因在體內(nèi)特定微環(huán)境下選擇性表達(dá)的結(jié)果，ADSC構(gòu)建軟骨組織的根本點(diǎn)就是要模仿體內(nèi)微環(huán)境，誘導(dǎo)基因選擇性表達(dá)。目前應(yīng)用于ADSC軟骨誘導(dǎo)的方法主要有如下幾種：

2.1 生長因子

多種生長因子在軟骨的發(fā)生中起重要作用。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族作用于軟骨分化的始終，該家族包括TGF-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）兩個(gè)亞家族，TGF-β亞家族抑制軟骨細(xì)胞的肥大分化，維持生長板中適量的軟骨細(xì)胞；BMP亞家族能起始間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化并維持軟骨細(xì)胞的特性，而且促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成熟。常染色體性別反轉(zhuǎn)基因（SOX9）家族是軟骨生成中發(fā)揮主導(dǎo)作用的另一調(diào)節(jié)因子，SOX9促進(jìn)前體干細(xì)胞的聚集，維持軟骨細(xì)胞增殖，抑制其向肥大軟骨細(xì)胞分化。此外胰島素樣生長因子（IGF-1）、軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白（CDMP1）等均發(fā)揮重要作用。在培養(yǎng)基中加入一種或多種生長因子可以誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞定向分化為軟骨細(xì)胞。如CDMP1的單獨(dú)應(yīng)用、TGF-β1和IGF-1的聯(lián)合應(yīng)用。聯(lián)合應(yīng)用的效果要優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。較為理想的添加細(xì)胞因子的方法是細(xì)胞因子的序貫應(yīng)用，但由于干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的機(jī)制尚不完全清楚，該方法受到限制。

2.2 共培養(yǎng)

軟骨細(xì)胞不僅可以分泌多種細(xì)胞因子如TGF-β等，還可以分泌Ⅱ型膠原等特異的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。軟骨細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)，在無需添加生長因子的條件下就能提供脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的微環(huán)境，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞形成，解決了生長因子造價(jià)高昂的缺點(diǎn)。張勇等分離共培養(yǎng)正常新西蘭大白兔的脂肪干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，證實(shí)與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，脂肪干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)成軟骨樣細(xì)胞。這一研究成果為共培養(yǎng)體內(nèi)修復(fù)軟骨損傷提供了依據(jù)。

2.3 轉(zhuǎn)基因

外源性生長因子持續(xù)時(shí)間短，需反復(fù)添加，造價(jià)高昂，基因工程技術(shù)與軟骨組織工程技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建基因工程化軟骨解決了上述問題。將各種生長因子的基因?qū)敕N子細(xì)胞中，使細(xì)胞在增殖分化的同時(shí)表達(dá)所需的生長因子，繼而通過自分泌或旁分泌途徑促進(jìn)其進(jìn)一步增殖分化，這已成為構(gòu)建軟骨組織工程的新途徑。賀明等用SOX-9和TGF-β1共同轉(zhuǎn)染大鼠脂肪干細(xì)胞，結(jié)果TGF-β1和Ⅱ型膠原表達(dá)均以SOX-9和TGF-β1共轉(zhuǎn)染組最多，證實(shí)SOX-9和TGF-β1共轉(zhuǎn)染ADSC成功誘導(dǎo)大鼠ADSC向軟骨細(xì)胞分化。這為外源性基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織工程種子細(xì)胞提供了依據(jù)。

2.4 疏密波

吳廣文等分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用疏密波誘導(dǎo)第三代細(xì)胞，誘導(dǎo)14d后，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞表型，并證實(shí)疏密波誘導(dǎo)的機(jī)制是上調(diào)核心結(jié)合因子a1和SOX-9 的mRNA的表達(dá)從而促進(jìn)糖胺聚糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)。鑒于脂肪干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的諸多相似性，我們有理由推測(cè)疏密波也可用于誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化。

3 面臨問題

雖然軟骨誘導(dǎo)的方法在不斷地改善，但是目前ADSC應(yīng)用于軟骨組織工程依然面臨很多問題。ADSC的成軟骨率有待提高，ADSC構(gòu)建軟骨組織的效果不如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞理想。目前尚未發(fā)現(xiàn)ADSC的特異性標(biāo)記物，無法得到純化的ADSC亞群，因此尋找ADSC特異性的表面標(biāo)志物對(duì)于ADSC的分離純化至關(guān)重要。另外ADSC體外長期培養(yǎng)的安全性有待進(jìn)一步證實(shí)，有研究稱長時(shí)間培養(yǎng)的ADSC可使免疫缺陷的小鼠發(fā)生腫瘤。

4 展 望

雖然ADSC在軟骨組織工程中的應(yīng)用還面臨問題，但是ADSC在取材和多向分化潛能方面的優(yōu)勢(shì)是肯定的。我們有理由相信，隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，諸多問題將被一一解決，ADSC在軟骨組織工程方面的前景將會(huì)更加美好。

[1] 張世浩,朱立新.關(guān)節(jié)軟骨組織工程種子細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2008,22(12):1505-1507.

[2] 楊柳,羅卓荊,胡蘊(yùn)玉,等.關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)不同時(shí)間去分化現(xiàn)象發(fā)生過程及規(guī)律[J].中國臨床康復(fù),2002,6(12):1372-1373.

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