張 明，黃金林，焦新安

空腸彎曲菌生物膜研究進(jìn)展＊

張 明，黃金林，焦新安

空腸彎曲菌是全球范圍內(nèi)主要的人獸共患性、細(xì)菌性腸道病原菌之一［1］，其感染率在世界各地普遍呈上升趨勢，主要引起人體急性腸炎和食物中毒，并伴發(fā)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肝炎、瑞特氏病和格林－巴利綜合征等免疫性損傷性疾?。?］。生物膜是指微生物在生長過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于生物材料或機(jī)體腔道表面，分泌黏性胞外基質(zhì)（extracellular polymeric substance，EPS）將其自身包裹成微菌落，并相互融合形成的高度組織化、系統(tǒng)化的微菌落膜性聚集物［3－4］。生物膜的形成在空腸彎曲菌傳播感染中扮演了重要的角色［5］，因此對于空腸彎曲菌生物膜基礎(chǔ)的研究具有重要的意義。本文對空腸彎曲菌生物膜的形成、相關(guān)基因、檢測分析方法、研究展望作了綜述。

1 空腸彎曲菌生物膜的形成

1．1 空腸彎曲菌生物膜的形成條件 空腸彎曲菌是世界范圍內(nèi)主要的食源性病原菌，與多數(shù)腸道細(xì)菌類似，在環(huán)境中主要以生物膜形式存在。溫度、氧氣、營養(yǎng)條件、吸附材料等環(huán)境條件都會影響空腸彎曲菌生物膜的形成［6］。Reeser等［5］定量測定了空腸彎曲菌在不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)溫度以及不同吸附材料表面生物膜的形成能力，研究表明在37℃條件下培養(yǎng)在MH肉湯中的空腸彎曲菌生物膜形成能力較高，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加葡萄糖、蔗糖、NaCl等都會減弱空腸彎曲菌生物膜的形成；而在不同的材料表面空腸彎曲菌形成生物膜的能力也不同，相對而言其更容易吸附在疏水材料表面形成生物膜。Reuter等［7］發(fā)現(xiàn)微需氧性（5%O2，10%CO2）的空腸彎曲菌在高的氧氣濃度下更有利于生物膜的形成。有學(xué)者通過研究空腸彎曲菌在可控制的混合微生物環(huán)境中的生物膜形成，發(fā)現(xiàn)不同的微生物環(huán)境能夠影響空腸彎曲菌生物膜的形成，如糞腸球菌和溶血性葡萄球菌能夠聯(lián)合空腸彎曲菌在微需氧條件下形成生物膜［8－9］。

1．2 空腸彎曲菌生物膜形成過程 空腸彎曲菌的生物膜形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，也是個(gè)動態(tài)的過程［10－11］?？傮w包括粘附、增殖、成熟三個(gè)階段。首先，浮游細(xì)胞接受環(huán)境的營養(yǎng)信號，對宿主表面進(jìn)行特異性的粘附，其中涉及到一些基因的表達(dá)以及蛋白的識別作用［12］，在這個(gè)階段單個(gè)附著的細(xì)胞僅由少量胞外聚合物包裹，研究顯示這些附著的細(xì)菌還未進(jìn)入生物膜的形成過程，很多菌體還可以重新進(jìn)入浮游生活方式，因而粘附的過程是可逆的［13］。當(dāng)細(xì)菌粘附到表面后，就開始大量繁殖進(jìn)入增殖階段，在這個(gè)階段菌體自身分泌大量的黏性胞外基質(zhì)［14］，細(xì)胞間互相粘附形成微菌落，此時(shí)細(xì)菌的抗性提高。最后，細(xì)菌在粘附表面形成的多個(gè)微菌落互相融合，繼續(xù)發(fā)展，形成彼此間有液體通道相連的成熟的細(xì)菌生物膜［15］。而生物膜的形成又是一個(gè)循環(huán)的過程，成熟生物膜上的一些細(xì)菌可以脫落到浮游環(huán)境中，又轉(zhuǎn)變成浮游生長狀態(tài)經(jīng)歷新的循環(huán)［16］。

2 空腸彎曲菌生物膜形成過程中的基因調(diào)控研究

空腸彎曲菌生物膜的形成過程牽涉到多種基因的表達(dá)以及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，目前對空腸彎曲菌生物膜的研究主要集中在對已知基因進(jìn)行缺失突變來探索對生物膜形成的影響規(guī)律。Asakura等［17］研究了有關(guān)細(xì)胞間結(jié)合蛋白Peb4（CBF2）對空腸彎曲菌生物膜的影響，研究表明Peb4突變株無論是在微需氧還是在有氧條件下，生物膜的形成都有一定程度的減弱。Reeser等［5］研究發(fā)現(xiàn)鞭毛在空腸彎曲菌生物膜形成過程中具有重要的作用，其鞭毛突變株與野生菌株相比形成生物膜能力較弱。另外，群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Quorum sensing）也參與生物膜形成整個(gè)過程，細(xì)菌通過群體感應(yīng)信號分子與周圍環(huán)境進(jìn)行交流，從而影響生物膜的形成［18］。研究表明空腸彎曲菌的有關(guān)群體感應(yīng)信號分子基因lux S在空腸彎曲菌生物膜的形成中起到重要的作用，lux S的突變株與野生株比較，生物膜形成能力有較大程度的減弱［19－20］。Fields等［21］研究發(fā)現(xiàn) Csr A 是空腸彎曲菌生物膜形成中的一個(gè)催化因子，其csr A突變株只形成了相當(dāng)于野生株一半的生物膜，而回復(fù)株生物膜的形成能力又是野生株的2倍左右。Niou等［22］研究了有關(guān)多糖合成的基因gal E對生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)其過量表達(dá)會較大程度提高空腸彎曲菌生物膜形成的能力。

3 空腸彎曲菌生物膜的檢測分析方法

近年來隨著對生物膜研究的不斷深入，出現(xiàn)了多種對生物膜的檢測方法，主要包括染色法（剛果紅染色法、銀染法、結(jié)晶紫染色法等）和顯微鏡觀察法。實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)不同的生物膜成分選擇不同的方法來進(jìn)行檢測，由于目前對空腸彎曲菌生物膜的成分缺乏了解，對其檢測分析就主要包括常規(guī)的結(jié)晶紫染色法和顯微鏡觀察法。

3．1 結(jié)晶紫染色法 利用生物膜內(nèi)物質(zhì)對結(jié)晶紫染料的結(jié)合，可以通過結(jié)晶紫染色法對生物膜進(jìn)行定量檢測。首先，將結(jié)晶紫溶液浸潤生物膜形成的表面，靜置一段時(shí)間后用水洗除去未結(jié)合的染料，然后用乙醇或乙酸溶液溶解附著于生物膜上的染料，最后用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測定有色溶液的吸光值［23］。Reeser等［5］利用結(jié)晶紫染色法對空腸彎曲菌生物膜的形成進(jìn)行了定量測定，并對不同培養(yǎng)條件進(jìn)行了比較。

3．2 顯微鏡觀察法 傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡觀察法，樣品制備簡單，易操作。但容易產(chǎn)生折射，生物膜結(jié)構(gòu)損壞嚴(yán)重且互相重疊，很難觀察到生物膜的具體結(jié)構(gòu)。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察法，樣品需經(jīng)過梯度脫水，電子束不穿過樣品，僅在樣品表面掃描激發(fā)出次級電子而成像，圖像有很強(qiáng)的立體感。但其樣品處理過程中很可能導(dǎo)致樣品變形，以及結(jié)構(gòu)的破壞，僅僅能夠觀察大致的形態(tài)學(xué)。

激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）觀察法，由于不需要樣品固定和包埋技術(shù)，因此不會破壞生物膜的結(jié)構(gòu)，使人們可以在第一時(shí)間直接觀察新鮮、完全水合的樣品。除了可以通過圖像軟件得到各個(gè)角度的生物膜三維視圖外，更有一些計(jì)算軟件可以將三維的圖像數(shù)據(jù)化，從而使生物膜的特征量化［24］。

4 展 望

空腸彎曲菌是一種重要的人獸共患病原菌，目前其致病機(jī)理還不是很明確，而生物膜可能是細(xì)菌致病性的一個(gè)重要機(jī)制。近年來隨著對空腸彎曲菌的研究越來越深入，對空腸彎曲菌生物膜的研究也在不斷發(fā)展，空腸彎曲菌生物膜的培養(yǎng)條件、定量測定方法以及一些基因?qū)ζ涞挠绊懸仓饾u明了；但目前空腸彎曲菌生物膜的研究只局限于表型的測定和已知基因的缺失突變等，而空腸彎曲菌生物膜基礎(chǔ)表型特征，基因間的調(diào)控表達(dá)以及形成過程中細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制等尚未闡明。因此今后空腸彎曲菌生物膜的研究方向應(yīng)集中于生物膜形成分子調(diào)節(jié)機(jī)制、相關(guān)基因之間的表達(dá)調(diào)控以及一些控制技術(shù)領(lǐng)域，對于空腸彎曲菌的傳播感染的控制具有重大的意義。

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R378．99

A

1002－2694（2011）10－0933－02

＊國家自然科學(xué)基金（31072150）、國家支撐計(jì)劃（2009BADB9B01）

焦新安，Email：jiao＠yzu．edu．cn

揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009

2011－03－29；

2011－06－25