張威威

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖北荊州434025)

秦公偉

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中723000)

程水源

(黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,湖北黃岡438000)

許 鋒

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖北荊州434025)

銀杏 (Ginkgo biloba)是現(xiàn)有種子植物中最古老的孑遺植物,又稱 “活化石”。銀杏壽命長,又名“公孫樹”。它原產(chǎn)中國,具有極高的經(jīng)濟、生態(tài)、觀賞和科研價值,尤其是銀杏體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)黃酮、帖內(nèi)酯的藥用價值[1],已受到世界范圍內(nèi)研究者日益廣泛的關(guān)注。

通過組織培養(yǎng)獲取大量細胞,從中提取黃酮、銀杏帖內(nèi)酯等藥用成分,不僅可以人為控制培養(yǎng)條件,選擇優(yōu)良細胞系得到較高含量的代謝產(chǎn)物,還具有速度快,周期短,效率高等特點。上世紀(jì)30年代以來,國內(nèi)外學(xué)者先后開展了銀杏配子體、胚、葉片、莖段等外植體培養(yǎng)研究。各種外植體在一定條件下已誘導(dǎo)出愈傷組織,但有關(guān)影響銀杏愈傷組織培養(yǎng)因子研究報道較少[2,3]。本研究通過對培養(yǎng)基、激素種類和濃度等培養(yǎng)條件進行了初步探討,以期尋求一種適合銀杏愈傷組織誘導(dǎo)的方法,為銀杏生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

銀杏葉采自長江大學(xué)銀杏科技園,銀杏品種為10年生家佛手,樹勢良好,生長正常。

1.2 方法

(1)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 采用的培養(yǎng)基為:①MS+NAA 2 mg/L+KT 1 mg/L;②MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L;③MS+NAA 2 mg/L+6-BA 1 mg/L。

(2)愈傷組織誘導(dǎo) 將剛采集的銀杏嫩葉先用自來水沖洗干凈,經(jīng)蒸餾水漂洗,裝入廣口瓶放入超凈工作臺,加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液滅菌約10 s,傾倒掉乙醇后,材料轉(zhuǎn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的升汞溶液中消毒8～10 min,完成后立即用無菌水沖洗3～4次[4,5]。夾取嫩葉,在滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)無菌濾紙上,將材料切分成3～5 mm的小塊,分別接種在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基上;每瓶接種4塊,每種培養(yǎng)基接種60瓶。

(3)培養(yǎng)條件 每天光照12 h左右,光照強度2 000 lx,溫度控制在 (28±1)℃,相對濕度60%～75%。

(4)指標(biāo)計算方法 分別按下述公式計算成活率、污染率、死亡率和愈傷組織誘導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基接種效果

外植體接種到培養(yǎng)基上,在設(shè)定的培養(yǎng)條件下光照培養(yǎng)。一周左右長出愈傷組織,數(shù)量不斷增多,體積膨大,顆粒化逐漸出現(xiàn)。培養(yǎng)基接種后生長狀況統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1 培養(yǎng)基接種效果

2.2 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將銀杏嫩葉消毒后接種在三種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)。銀杏嫩葉所誘導(dǎo)的愈傷組織的生長周期約為30 d左右,其生長延緩期約為10 d,第10至25 d為快速生長期,25 d后進入穩(wěn)定期,穩(wěn)定期過后,愈傷組織很快衰老,變褐死亡。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選試驗中,圖1是在接種后第15 d的愈傷組織生長效果。

從圖1中可知,①號培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織淡綠色、生長量少、顆粒化不很明顯;②號培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織淺黃綠色、生長量多、顆粒化明顯、排列疏松;③號培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織綠色、生長量多、顆?；幻黠@、排列緊密。結(jié)果表明,在相同種類水平生長素 (NAA 2 mg/L),相同種類較低水平細胞分裂素 (KT①號培養(yǎng)基1 mg/L,②號培養(yǎng)基0.1 mg/L)有利于愈傷組織生長,顆粒化;不同種類相同水平細胞分裂素 (①號培養(yǎng)基KT 1 mg/L,③號培養(yǎng)基6-BA 1 mg/L),6-BA有利于愈傷組織生長,但顆?；幻黠@,細胞排列密實;綜合比較三種培養(yǎng)基上愈傷組織生長狀況,②號培養(yǎng)基MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L比較適合銀杏嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo),所得愈傷組織相對較好,適合進一步后期的繼代培養(yǎng)或者細胞懸浮培養(yǎng)研究。

圖1 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織

3 討論與小結(jié)

植物生長所需要的培養(yǎng)基成分包括碳源、大量元素、微量元素、鐵鹽、有機成分和植物生長調(diào)節(jié)劑。因各種植物對營養(yǎng)成分的需要不同,培養(yǎng)基中各組分的濃度和不同組合,將對植物的生長產(chǎn)生不同的影響。為了選擇銀杏愈傷組織誘導(dǎo)生長的最適培養(yǎng)基,本試驗參考于榮敏等[6]、曉原等[7]和楊林等[8]的研究結(jié)果,在以往的研究基礎(chǔ)上,進一步分析了6-BA、KT、及NAA三種激素不同配比組合在愈傷組織誘導(dǎo)中的作用;通過培養(yǎng)基的篩選誘導(dǎo)愈傷組織,獲得了生長速度快、顆?；?、疏松的愈傷組織,得到的銀杏嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+NAA 2 mg/L+KT 0.1 mg/L,與于榮敏等[6]的研究結(jié)果相近。

[1]龐 允,楊建秀,劉子蘭.銀杏葉中黃酮的提取工藝比較 [J].制劑技術(shù),2007,16(3):38～39.

[2]Tuleck e W R.A tissue derived from the pollen of Ginkgobiloba[J].Science.1953,117:559～600.

[3]羅紫娟.銀杳組織培養(yǎng)的韌步研究 [J].云南植物研究,1984,6(1):93～97.

[4]王德強,王曉玲.銀杏細胞的懸浮培養(yǎng)研究 [J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2005,24(3):27～29.

[5]郭 勇,崔堂兵,謝秀禎.植物細胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004.7.

[6]于榮敏,趙鴻蓮,張 輝,等.銀杏細胞懸浮培養(yǎng)及其銀杏內(nèi)酯產(chǎn)生的研究 [J].生物工程學(xué)報,1999,15(2):207～210.

[7]曉 原,曹有龍.外部因子條件對麻黃細胞懸浮培養(yǎng)的影響[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2001,22(3):48～52.

[8]楊 林,周吉源.銀杏細胞懸浮培養(yǎng)及黃酮的產(chǎn)生 [J].中央民族大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版),2002,11(1):55～58.