歐立軍 ，張人文 ，譚智文 ，蔣向輝 ，佘朝文

（1.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化，41800；

2.湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.懷化學(xué)院生命科學(xué)系）

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）又名四季豆、梅豆、蕓豆，因其色澤嫩綠、肉莢肥厚、味道鮮美、極富營養(yǎng)價(jià)值而深受廣大消費(fèi)者的喜愛，是一種鮮嫩可口，色、香、味俱全，營養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)蔬菜。19世紀(jì)末期之前，人們認(rèn)為普通菜豆起源于亞洲[1]。根據(jù)形態(tài)學(xué)與生物化學(xué)的證據(jù)顯示，秘魯南部、玻利維亞和阿根廷地區(qū)是野生菜豆的一個(gè)起源中心，即安第斯中心；墨西哥、危地馬拉、巴拿馬、洪都拉斯、尼瓜拉加、哥斯達(dá)黎加和哥倫比亞等地區(qū)是另一個(gè)起源中心，即中美洲中心[2]。野生菜豆在這2個(gè)中心分別被馴化成栽培植物，然后才逐漸被引入世界各地，包括南美、北美、非洲、歐洲和亞洲的一些地區(qū)[3]。普通菜豆于16世紀(jì)初傳到歐洲，16世紀(jì)和17世紀(jì)在歐洲迅速傳播，并且在西班牙和葡萄牙北部地區(qū)形成了大粒白蕓豆的次級(jí)多樣性中心[4～5]。隨后，普通菜豆由這一地區(qū)傳播到歐洲其他地區(qū)，再由歐洲傳入中東、西亞以及世界上其他國家和地區(qū)[6]。普通菜豆傳入非洲的具體時(shí)間不太清楚，但是2個(gè)起源中心的材料在非洲都存在并且主要以安第斯中心的材料為主[4]。鄭卓杰等[7]認(rèn)為，中國栽培的菜豆是15世紀(jì)直接從美洲引入的，但尚缺乏直接有力的證據(jù)。

高等植物中的rRNA基因是高度重復(fù)的串聯(lián)序列，18S、5.8S和26S rDNA連結(jié)在一起作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，拷貝數(shù)可達(dá)500～40 000，ITS序列包括被5.8S隔開的ITS1和ITS2。編碼18S、5.8S和26S的序列為高度保守區(qū)，ITS序列為進(jìn)化速度較快的中度保守序列，且各重復(fù)單元間具有同步進(jìn)化的特點(diǎn)。因此，ITS作為基因標(biāo)記很快成為在序列水平上探討系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究的有效手段[8～11]。

本文基于ITS序列對(duì)來自不同國家的菜豆進(jìn)行聚類分析，從分子水平探討菜豆種質(zhì)的親緣關(guān)系，以期為菜豆核心種質(zhì)篩選和優(yōu)異種質(zhì)培養(yǎng)提供理論依據(jù)，同時(shí)為確定菜豆的起源及次級(jí)起源中心提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

16份菜豆種質(zhì)來自亞洲、歐洲、美洲和非洲，每份材料取3個(gè)樣本（表1），由美國農(nóng)業(yè)部種子庫和民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

采取CTAB法提取DNA。ITS引物采用參考White 等[12]，5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，5'-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3'，反應(yīng)體系包括10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，50 mmol/L 引物各 1 μL，DNA 40 ng，Taq DNApolymerase 0.4 μL，補(bǔ)充雙蒸水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min；94℃變性 45 s，56℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化用購自上海生工的DNA純化試劑盒。純化產(chǎn)物鑒定后送往上海生工雙向測序。所得序列采用 DNAMAN和MEGA.4軟件進(jìn)行分析并提交Genebank得到登錄號(hào)。

表1 材料及來源

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，ITS片段大小在700 bp左右（圖1a），純化后條帶清晰，達(dá)到測序要求（圖1b）。測序分析發(fā)現(xiàn)，ITS序列長度很保守，為645 bp或635 bp，片段大小相差10 bp，變異為1.5%；GC含量變化較大，在52.8%～57.1%波動(dòng)；ITS1片段為 250 bp或259 bp，GC含量較高，變化范圍不大，在58.7%～59.9%波動(dòng)；ITS2片段長度為222 bp或223 bp，相差僅1個(gè)bp，GC含量在57.9%～60.3%波動(dòng)（表2）。

2.2 遺傳相似度分析

16份種質(zhì)的ITS1相似度為88.13%，ITS2相似度為 85.14%，ITS1的相似度高于ITS2。除種質(zhì)14和16外，其他14份種質(zhì)的相似度很高，其中ITS1的相似度達(dá)到99.35%，ITS2則為93.56%，以上結(jié)果說明ITS2片段的遺傳多態(tài)性高于ITS1片段。

2.3 同源樹分析

圖1 菜豆ITS PCR擴(kuò)增（a）和純化（b）

表2 菜豆ITS序列長度和GC含量

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的同源樹

基于ITS序列構(gòu)建同源樹，不同菜豆種質(zhì)被分為2大支，來自西班牙的菜豆與來自坦桑尼亞的菜豆為1大支，其他種質(zhì)為另1大支。第2大支中，來自中國的菜豆優(yōu)先與來自印度的菜豆聚類，然后與來自保加利亞的菜豆聚類；來自日本的菜豆與來自俄羅斯的菜豆優(yōu)先聚類，其他來自歐洲的菜豆優(yōu)先聚類后與來自亞洲的菜豆聚類，然后與來自美洲的菜豆聚類（圖2）。

3 小結(jié)與討論

來自葡萄牙和哥倫比亞菜豆種質(zhì)ITS序列完全相同，這與Santalla等[5]提出的普通菜豆于16世紀(jì)初由美洲傳到歐洲，然后16世紀(jì)和17世紀(jì)在歐洲迅速傳播，并且與在西班牙和葡萄牙北部地區(qū)形成了大粒白蕓豆的次級(jí)多樣性中心的說法一致。來自坦桑尼亞和西班牙的菜豆的ITS序列特點(diǎn)相近，序列長度均為635 bp（其他種質(zhì)都為645 bp），在進(jìn)化樹上聚為一類，表明坦桑尼亞的菜豆可能直接來自于歐洲的西班牙。來自非洲阿爾巴尼亞的菜豆則與來自歐洲的菜豆優(yōu)先聚類，說明非洲的菜豆可能直接來自歐洲，這與Schoonhoven等[13]提出非洲是菜豆第2遺傳中心的說法不相一致，因此非洲是否為菜豆的次級(jí)起源中心有待深入研究。

來自中國的菜豆優(yōu)先與來自歐洲的菜豆聚類后，再與來自美洲的菜豆聚類，表明中國的菜豆與歐洲的菜豆之間的親緣關(guān)系更為密切，與鄭卓杰[7]通過形態(tài)學(xué)比較提出中國的菜豆是15世紀(jì)直接從美洲引進(jìn)的說法不一致。考證歷史發(fā)現(xiàn)，1497年，葡萄牙航海家達(dá)·伽馬經(jīng)過加那利群島，繞好望角，經(jīng)莫桑比克等地，于1498年到達(dá)印度西南部卡利卡特，1869年蘇伊士運(yùn)河通航前，歐洲對(duì)印度洋沿岸各國和中國的貿(mào)易，主要通過這條航路，因此中國的菜豆可能是通過這條航路傳播過來的。通過基因組得到的結(jié)果比形態(tài)上得到的結(jié)果更可靠，雖然本研究僅僅分析了1個(gè)DNA片斷，但這個(gè)片段是常用來進(jìn)行物種內(nèi)遺傳進(jìn)化的分子標(biāo)記，因此本研究認(rèn)為中國的菜豆是否直接從美洲引進(jìn)值得商榷，并且更有可能是來自于歐洲。

[1]Linnaeus C.Species plantarum[M].London:England,Ray Society,1753.

[2]Gepts P,Bliss F A.Dissemination pathways of common bean(Phaseolus vulgrisFabaceae)deduced from phaseolin electrophoretic variability.II.Europe and Africa[J].Economic Botany,1988,42(1):86-104.

[3]Broughton W J,Hernández G,Blair M,et al.Vanderleyden Beans(Phaseolusspp.)-model food legumes[J].Plant and Soil,2003,252:55-128.

[4]Singh S P.Patterns of variation in cultivated common bean(Phaseolus vulgarisFabaceae)[J].Economic Botany,1989,43:39-57.

[5]Santalla M,Rodino A,De Ron A.Allozyme evidence supporting southwestern Europe as a secondary center of genetic diversity for common bean[J].Theoretical and Applied Genetics,2002,104:934-944.

[6]Smartt J,Simmonds N W.Evolution of Crop Plants[M].UK:Longman Scientific and Technical,1995:287-296.

[7]鄭卓杰.中國食用豆類學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[8]Mao S,Kenji K,Eiji M,et al.Identification of medicinal A-tractylodes based on ITS sequences of nrDNA [J].Biol Pharm Bull,2006,29(2):315-320.

[9]Christopher H J,Kenneth J S,Harvey E B J.Evolutionary relationships,interisland biogeography,and molecular evolution in the Hawaiian violets(Viola:Violaceae)[J].American Journal of Botany,2009,96:2 087-2 099.

[10]Vijaykumar A,Saini A,Jawali N.Phylogenetic analysis of subgenus vigna species using nuclear ribosomal RNA ITS:evidence of hybridization among vigna unguiculata subspecies[J].Journal of Heredity,2010,101:177-188.

[11]Yan J,Deng J,Zhou C J,et al.Phenotypic and molecular characterization ofMadurella pseudomycetomatissp.nov.,a novel opportunistic fungus possibly causing black-grain mycetoma[J].Journal of Clinical Microbiology,2010,48:251-257.

[12]White T J,Bruns T,Lee S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//In:Innes M,Gelfand D,Sninsky J,et al.eds.PCR protocols:a guide to methods and applications,1990,315-322.

[13]Schoonhoven A V,Voyest O.Common beans:Research for Crop Improvement[M].CABI,1991.