郭麗麗 綜述 吳志浩 周清華 審校

作者單位：300052 天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點實驗室（通訊作者：吳志浩，E-mail:zwu2ster@gmail.com；周清華，E-mail: zhouqh1016@yahoo.com.cn）

肺癌是目前世界上最常見的癌癥之一，約占所有癌癥病例的15%，而吸煙是目前公認的引起肺癌的主要危險因素之一，在發(fā)展中國家，約80%的肺癌病例與吸煙有關(guān)[1]。肺癌的預(yù)后總體上仍然不是很樂觀，男性的5年生存率為6%-14%，女性為7%-18%[2]。在香煙煙霧約4,000多種化學(xué)物質(zhì)中，已有60多種被確定為致癌物，它們大多通過與DNA相互作用，導(dǎo)致DNA加合物的形成，從而引起細胞中遺傳物質(zhì)或基因的改變。尼古丁是煙草的主要成分之一，其作用主要是導(dǎo)致吸煙者的成癮性。

尼古丁對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用主要是通過尼古丁乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptors, nAChR）實現(xiàn)的。除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，全身許多細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞、脂肪細胞、角質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞及腸道和肺的上皮細胞均表達nAChR。尼古丁及其受體nAChR在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，包括調(diào)控細胞增殖、細胞凋亡、新生血管的形成及腫瘤的侵襲等[3]。因此，本文將對尼古丁在肺癌及其演進過程中所扮演的角色作一綜述。

1 尼古丁及其受體nAChR

尼古丁的多種功能特性是通過其與各種類型nAChR的相互作用而形成的。nAChR是由各種不同亞單位組成的同源及異源性五聚體構(gòu)成（α1-10, β1-4）的[4,5]。尼古丁是一種非選擇性nAChR激動劑，nAChR五聚體中的β2或β4亞單位與其對尼古丁的親和力高低有關(guān)。尼古丁可激活多種nAChR亞型，作用于交感和副交感神經(jīng)系統(tǒng)，引起一系列反應(yīng)。nAChR的上調(diào)或下調(diào)可對心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生生理學(xué)效應(yīng)[6-8]。其中研究最多的是香煙的成癮性效應(yīng)[9,10]。同其它成癮性藥物一樣，尼古丁可使大腦中阿肯柏氏核多巴胺水平增高，進而加強藥物的利用或消耗[11]。

2 肺組織中的nAChR

1997年發(fā)現(xiàn)正常人支氣管上皮細胞（bronchial epithelial cells, BEC）表達α3-、α4-、α5-及α7-四種nAChR亞單位，這4個亞單位形成鈣離子調(diào)控通道從而調(diào)節(jié)細胞的粘附和運動[12]。之后又發(fā)現(xiàn)在BEC中尼古丁的結(jié)合位點具有飽和性。RT-PCR、原位雜交等技術(shù)證實了BEC中α7-nAChR的存在[13]。值得關(guān)注的是，West等[14]發(fā)現(xiàn)起源于大氣道的BEC和小氣道上皮細胞（small airway epithelial cells, SAEC）的BEC，兩者的nAChR類型有略微不同。BEC選擇性表達α3-和α5-nAChR亞單位，而SAEC選擇性表達α2-和α4-亞單位，兩者都表達α7-、α10-、β2-和β4-亞單位。Plummer等[15]研究表明在正常肺組織細胞和肺癌細胞（包括鱗癌、類癌、腺癌、大細胞癌和小細胞癌）中都廣泛表達α7-nAChR。由此推斷，肺上皮細胞可能廣泛表達α7-nAChR，這也提示它在肺組織生物學(xué)中的重要作用。

3 尼古丁及nAChR對正常肺組織的作用

近年來，隨著肺組織細胞中尼古丁乙酰膽堿受體nAChR的發(fā)現(xiàn)，膽堿類藥物在肺癌發(fā)展過程中的作用得到了更多的研究[16,17]。吸煙人群中，血漿尼古丁水平的峰值在白天可達到200 nM左右，在夜晚入睡時則可降至5 nM-10 nM，而直接暴露于煙霧的肺氣道的尼古丁水平可升至5倍-10倍，而且峰值和最低值更為明顯[19]。這樣高的水平足夠激活α4β2-nAChR[18,19]，而且也可能激活α7-nAChR[20]。

粘膜下腺體的上皮細胞中大量表達α7-nAChR。吸煙可明顯增加nAChR的相對數(shù)量，而這一效應(yīng)可在10 μM尼古丁處理的BEC培養(yǎng)液中被復(fù)制[15]。Lam等[21]最近發(fā)現(xiàn)100 nM尼古丁處理BEC細胞72 h后和144 h后，α1-、α5-、α7-nAChR的RNA水平在72 h明顯增加，而撤去尼古丁后，又回到基礎(chǔ)水平。為了更深入地探討這些分子機制，有研究[22]采用5 μM尼古丁分別處理BEC 4 h、8 h、10 h后，通過微陣列-生物信息學(xué)分析尼古丁所誘導(dǎo)的基因表達圖譜發(fā)現(xiàn)，在所分析的1,800個基因中，260個基因明顯上調(diào)，17個基因明顯下調(diào)。

用尼古丁處理兔肺上皮細胞不同時間發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)多條通路的活化狀況也不同[23]。其中，蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl-inositide 3 kinase, PI3K）在尼古丁處理后可暫時激活。Ras及其下游效應(yīng)分子細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 （extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2）在長時間暴露于尼古丁后也可激活。尼古丁激活Ras是氨甲蝶林（methotrexate, MTX）所介導(dǎo)的G1期檢測點受到干擾及活性氧族產(chǎn)生增加的原因[23]。這些數(shù)據(jù)表明持續(xù)暴露于尼古丁可干擾G1期檢測點，并且可通過活性氧族的產(chǎn)生引起DNA損傷。尼古丁激活的多條信號通路中研究最成熟最廣泛的是PI3K/Akt信號通路。尼古丁可在幾分鐘內(nèi)激活A(yù)kt，在45 min-50 min達到高峰，且可以維持數(shù)小時。吸煙的肺癌患者體內(nèi)磷酸化Akt的存在提示尼古丁激活A(yù)kt不僅局限在原代培養(yǎng)細胞，而且存在于肺癌細胞。而一旦被尼古丁激活，Akt就可使多個調(diào)控細胞周期和蛋白翻譯的下游分子發(fā)生磷酸化，如糖原合成酶-3 （glycogen synthase kinase-3, GSK-3）、真核翻譯起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor, 4EBP-1）及核糖體激酶p70S6K[14]。肺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞（pulmonary neuroendocrine cells, PNEC）是氣道上皮細胞中極為特殊的一部分，它們含有并且可以分泌生物胺，尤其是5-羥色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）和各種多肽[24,25]。通過分析游離的兔氣管中5-HT的釋放，發(fā)現(xiàn)PNEC的分泌活性是通過尼古丁受體介導(dǎo)的[26]。并且尼古丁受體誘導(dǎo)的5-HT的釋放同樣可存在于體外培養(yǎng)的PNEC細胞中[27]。Roman等[28]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于尼古丁的小鼠其纖連蛋白mRNA和蛋白的水平均增高。免疫組化的結(jié)果也表明尼古丁與肺泡、氣道上皮及血管中纖連蛋白蛋白水平的增高有關(guān)。以上數(shù)據(jù)提示尼古丁通過刺激α7-nAChR依賴的信號通路誘導(dǎo)成纖維細胞產(chǎn)生纖連蛋白，從而導(dǎo)致肺細胞基質(zhì)成分發(fā)生改變。尼古丁可能通過此種機制促進氣道周圍及肺實質(zhì)的組織重塑，這也可能是煙草會導(dǎo)致肺功能異常的機制之一。

4 尼古丁作為致癌物

Hecht等[29]假設(shè)尼古丁是經(jīng)2'-羥基進行代謝的，它最終生成酮酸和羥基酸作為尿液新陳代謝的產(chǎn)物。雖然這條通路在哺乳動物中未建立起來，但它仍然具有重要的意義，因為尼古丁的產(chǎn)物，2'-羥基,4-(甲胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(氨基酮)，可轉(zhuǎn)變?yōu)闊煵?特異性的肺部強致癌物4-(甲基亞硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁酮。將尼古丁與細胞色素P450 2A6共同孵育可產(chǎn)生氨基酮，用氨基酮做媒介，將人肝細胞微粒體與尼古丁共同孵育則可產(chǎn)生酮酸。最近有文獻[30]對與尼古丁結(jié)構(gòu)相似的致癌物亞硝胺4-(甲基亞硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(nitrosamines 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, NNK)和N'-亞硝基去甲基煙堿（N'-nitrosonornicotine, NNN）的作用機制做了闡明。NNK對α7-nAChR具有高度親和性，用NNK或尼古丁處理小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）或PNEC，可使α7-nAChR的表達增加，引起鈣離子內(nèi)流，激活PKC、Raf-1、ERK1/2和c-myc，導(dǎo)致細胞增殖。NNK或NNN處理支氣管肺泡細胞BEP2D后，細胞增殖潛能增強，并且可被α-BTX阻斷，同時，增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）和凋亡抑制蛋白Bcl-2基因表達成倍增加。NNK激活nAChR可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子GATA-3、核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-1（signal transducer and activator of transcription, STAT-1）的激活，而NNN主要激活GATA-3和STAT-1。這些數(shù)據(jù)均表明NNK和NNN的功能是通過nAChR實現(xiàn)的，并且nAChR拮抗劑有可能成為腫瘤化學(xué)預(yù)防的藥物[31]。

5 尼古丁及其受體nAChR在肺癌中的作用

肺癌從組織學(xué)上主要分為：類癌、SCLC和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）。NSCLC又分為：腺癌（adenocarcinoma, AD）、鱗癌（squamous cell carcinoma, SQ）及大細胞癌。腺癌是男女性共發(fā)的最常見的組織學(xué)類型，但與男性相比，女性中腺癌更為常見，而鱗癌則較少。香煙煙霧與上述幾種組織亞型均有關(guān)聯(lián)，但是吸煙者最容易發(fā)展為鱗癌。

SCLC和NSCLC細胞系均存在α7-nAChR[32]。研究[21]表明，非吸煙肺癌患者體內(nèi)α6-和β3-nAChR的表達水平較吸煙患者高。最近，全基因組相關(guān)性研究（genomewide association studies, GWAS）表明人類染色體15q24-25與肺癌的高風(fēng)險具有顯著關(guān)系[33]。通過單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）分析發(fā)現(xiàn)，染色體15q24-25區(qū)域包含有編碼α3-、α5-及β4-nAChR的基因簇CHRNA5、CHRNA3及CHRNB5[33,34]，并且，α5-α3-nAChR與吸煙相關(guān)性肺癌具有特異性，而與不吸煙性肺癌及其它吸煙相關(guān)性癌癥如膀胱癌和腎癌無關(guān)。此外，最新的研究[35]還表明，除了肺癌，α9-nAChR在與吸煙相關(guān)的人乳腺癌中也存在過表達，且尼古丁可通過上調(diào)α9-nAChR的表達誘導(dǎo)正常乳腺上皮細胞MCF-10A的轉(zhuǎn)化。

目前發(fā)現(xiàn)尼古丁在肺癌細胞（SCLC和NSCLC）中的主要作用為促進腫瘤細胞增殖和抑制藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡。A549細胞同其它肺腺癌細胞一樣，存在一個有活性的膽堿能系統(tǒng)，包括Ach、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase, ChAT）、積聚有膽堿的膜囊泡、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase, AChE）及nAChR[36]。將A549細胞接種到免疫缺陷小鼠NOD/SCID，發(fā)現(xiàn)尼古丁可明顯促進腫瘤的生長，而尾靜脈注射一定量的尼古丁（0.6 mg/kg，＞15 d），則可降低細胞凋亡（TUNEL分析）、增加血管的數(shù)量（CD31陽性細胞百分比）及增加Ki67的表達。Ki67是腫瘤細胞增殖的標記物，可反映腫瘤內(nèi)磷酸化AKT的水平[37]。以上這些數(shù)據(jù)均表明尼古丁在腫瘤進展中具有一定的作用。尼古丁在腫瘤發(fā)展中的作用不僅與新生血管數(shù)量的增加有關(guān)，而且可能參與細胞死亡和增殖的調(diào)控。

5.1 細胞增殖方面 有研究[38]表明，在倉鼠中單獨的尼古丁可能并不會導(dǎo)致肺癌的發(fā)生，而尼古丁伴有缺氧則可以誘發(fā)肺癌，從而提示長期的nAChR的活化伴有缺氧損傷可引起腫瘤的發(fā)生。在NSCLC中，尼古丁可以靶向表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）的釋放，導(dǎo)致EGF結(jié)合到其受體EGFR，并激活Ras-Raf-ERK信號通路，從而導(dǎo)致細胞增殖[39,40]。Ras-Raf-ERK信號通路可被α7-nAChR拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素（α-bungarotoxin, α-BTX）和α-環(huán)磷酰胺（α-cobratoxin, α-CTX）所阻斷[41]。此外，β-arrestin信號通路也可參與尼古丁誘導(dǎo)的細胞增殖[42]。β-arrestin結(jié)合到α7-nAChR可激活Src和Raf通路，Raf又結(jié)合到Rb，Rb的失活最終導(dǎo)致細胞進入S期。這一通路可被α-BTx及另外一種α7-nAChR拮抗劑MLA（methyllycaconitine）阻斷。另外，尼古丁還可激活PI3K及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（manmal target of rapamycin, mTOR），導(dǎo)致細胞增殖[43]。

5.2 細胞凋亡方面 尼古丁通過激活PI3K/Akt直接使Bax磷酸化從而使其凋亡的功能失活[44,45]。尼古丁還可引起Akt下游底物如GSK-3、p70S6K、4EBP-1的磷酸化參與細胞凋亡的抑制[14]。Akt的激活還可使凋亡抑制蛋白Survivin和XIAP水平上調(diào)，從而在尼古丁抗凋亡活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[46]。尼古丁通過上調(diào)NF-κB發(fā)揮其抗凋亡的作用[47]。

5.3 新生血管形成方面 Heeschen等[48]從解剖結(jié)構(gòu)及功能上證實了尼古丁可以誘導(dǎo)血管形成。同時，他們也證明了尼古丁可加速腫瘤和動脈粥樣斑的生長，并伴有新生血管形成的增加。在老鼠后肢缺血模型中，尼古丁可促進毛細血管及其附屬物的生長，促進組織的灌注。尼古丁的以上這些效應(yīng)都是通過nAChR介導(dǎo)的，內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的氮氧化物、前列腺素及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）都有可能在這些效應(yīng)中發(fā)揮作用。有研究[49]表明，尼古丁作為二手煙（second-hand smoke, SHS）的主要成分之一，與血漿中一些血管源性細胞因子如VEGF的增加有關(guān)，而SHS的血管效應(yīng)可被內(nèi)皮細胞的nAChR抑制劑所阻斷。此外，有研究[50]表明，尼古丁還可通過刺激缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor,HIF-1α）的積聚而調(diào)控新生血管的形成。

5.4 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面 上皮細胞間質(zhì)化（epithelialmesenchymal transition, EMT）與細胞運動能力及侵襲能力的增加有密切關(guān)系，也是目前腫瘤轉(zhuǎn)移研究的熱點之一。尼古丁可引起上皮細胞的標記物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）及緊密結(jié)合蛋白ZO-1的表達下降，同時間質(zhì)細胞標記物纖連蛋白和波形蛋白（vimentin）的表達增加[51,52]。此外，尼古丁可通過激活與人肺癌細胞遷移和侵襲有關(guān)的PKC誘導(dǎo)μ-和m-鈣激活酶（calpains）的磷酸化，從而激活細胞運動的信號[53]。在體內(nèi)，PKC可直接磷酸化μ-和m-鈣激活酶，PKC的過表達可導(dǎo)致μ-和m-鈣激活酶磷酸化的增加。尼古丁還可誘導(dǎo)c-Src的活化，它是PKC的上游激酶。用α-BTX處理細胞，可阻斷尼古丁誘導(dǎo)的鈣激活酶的磷酸化并抑制鈣激活酶的活性，抑制創(chuàng)傷修復(fù)、細胞遷移和侵襲，這表明尼古丁誘導(dǎo)鈣激活酶的磷酸化在一定程度上是通過α7-nAChR實現(xiàn)的。通過RNA干擾技術(shù)靶向沉默PKC的表達可抑制尼古丁誘導(dǎo)的鈣激活酶的磷酸化及其活性，抑制細胞的遷移和侵襲，表明PKC是尼古丁介導(dǎo)的細胞運動的必要組成部分。此外，尼古丁還可誘導(dǎo)μ-和m-鈣激活酶從肺癌細胞中分泌到培養(yǎng)基中，這有可能導(dǎo)致細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）中底物的裂解。以上這些發(fā)現(xiàn)揭示了PKC通過鈣激活酶的激活，在人肺癌細胞的遷移和侵襲中所扮演的新角色。

6 結(jié)語

盡管沒有證據(jù)表明尼古丁本身可以誘導(dǎo)肺癌，但是眾多研究證實尼古丁可以促進體內(nèi)癌細胞的生長，促進內(nèi)皮細胞的增殖，其中，尼古丁乙酰膽堿受體nAChR起著重要的介導(dǎo)作用，尼古丁通過激活不同的nAChR亞型發(fā)揮其在肺癌中的重要作用。通過抑制nAChR的蛋白水平可明顯消除尼古丁及NNK在腫瘤模型中誘導(dǎo)細胞增殖的作用。這些發(fā)現(xiàn)將有助于我們更好地研究和理解尼古丁及nAChR在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。目前，已有一些nAChR特異性的激動劑及拮抗劑用于多種疾病治療的臨床試驗（癌癥除外），因此，特異性靶向腫瘤中過表達的nAChR亞型的拮抗劑可能會為今后腫瘤的治療提供一種新的途徑[54]。